经鼻免疫壳聚糖-肺炎球菌表面粘附素DNA纳米微粒预防中耳炎的实验研究

肺炎链球菌是中耳炎的主要致病菌，通过粘膜途径引起感染。以肺炎链球菌血清型为基础的多糖和多糖蛋白结合疫苗存在血清型限制，且腹腔或肌肉注射免疫途径难以引起局部粘膜免疫反应。肺炎链球菌表面粘附素A（PsaA）是肺炎链球菌自身蛋白抗原之一，具有非血清依赖性，并与肺炎链球菌在鼻咽部定殖有密切相关性。本研究综合DNA疫苗诱生体液及细胞免疫的优势、经鼻免疫既能诱发全身免疫反应又能产生局部粘膜免疫反应的优点以及壳聚糖增强粘膜吸收和缓释的特性，设计旨在增强粘膜免疫应答的以壳聚糖为载体的肺炎球菌粘附素DNA纳米微粒，研究其经鼻免疫诱导体内免疫应答情况、对小鼠肺炎链球菌鼻咽部定植及中耳炎免疫保护作用，同时探讨其预防小鼠肺炎链球菌粘膜感染的免疫保护机制，为新型疫苗的分子设计提供研究思路。

研究chitosan包裹PsaA核酸形成的纳米颗粒经鼻腔黏膜途径免疫在BALB/c小鼠体内诱导的特异性免疫应答能力以及对肺炎链球菌急性中耳炎和鼻咽部定植的保护作用。从肺炎链球菌基因组成功扩增PsaA编码序列，经测序鉴定与GenBank中序列一致，成功构建了pVAX1-psaA真核表达载体，经RT-PCR和Western blot鉴定该质粒可以在体外培养的真核细胞中表达；制备了平均大小为392nm、表面电位为+12.5mV的chitosan-psaA纳米颗粒，该纳米颗粒具有保护pVAX1-psaA免遭DNaseⅠ降解作用；chitosan-psaA免疫组在小鼠体内诱导产生的血清中PsaA特异性IgG、IgG1、IgG2a、粘膜IgA抗体水平及IL-17A、IFN-γ水平与裸psaA组及chitosan-pVAX1组相比均明显升高，且差异具有统计学意义（P＜0.05）；chitosan-psaA组较裸psaA组及chitosan-pVAX1组小鼠肺炎链球菌鼻咽部的定植量明显降低（P＜0.05）；鼻腔攻毒前黏膜IL-17A水平较低，攻毒后IL-17A水平升高，chitosan-psaA免疫组明显高于裸psaA组及chitosan-pVAX1组（P＜0.05），提示IL-17A可能参与了局部黏膜免疫，有利于肺炎链球菌从鼻咽部的清除。评估chitosan-psaA纳米颗粒对急性中耳炎的保护作用结果表明chitosan可以增强psaA黏膜免疫后清除肺炎链球菌的能力。抗体功能实验表明chitosan-psaA组小鼠的血清抗体有较高的抗体结合功能、抑制黏附功能和调理吞噬功能，参与了黏膜保护机制。本研究获得的chitosan-psaA纳米颗粒是一种有效的黏膜免疫疫苗，以其黏膜免疫可望应用于肺炎链球菌感染的防治研究，该免疫策略研究为新一代肺炎链球菌疫苗的设计提供了实验基础。研究chitosan包裹PsaA核酸形成的纳米颗粒经鼻腔黏膜途径免疫在BALB/c小鼠体内诱导的特异性免疫应答能力以及对肺炎链球菌急性中耳炎和鼻咽部定植的保护作用。从肺炎链球菌基因组成功扩增PsaA编码序列，经测序鉴定与GenBank中序列一致，成功构建了pVAX1-psaA真核表达载体，经RT-PCR和Western blot鉴定该质粒可以在体外培养的真核细胞中表达；制备了平均大小为392nm、表面电位为+12.