异动症模型鼠Src介导NR2B酪氨酸超磷酸化的正反馈机制及特异性干扰肽的干预研究

Abnormality in Src•PSD-95•NR2B signaling complex assemble occurs in levodopa-induced dyskinesia (LID). NR2B subunit tyrosine phosphorylation mediated by Src family protein tyrosine kinases is closely associated with dyskinesia. Src autophosphorylation (p-Src) is an important part of Src catalyzed phosphorylation of NR2B. Recent research has indicated that the “NMDA→Ca2+→Ca2+.CaM/PKC→p-Pyk2→p-Src→p-NR2B→NMDA” and “NMDA-nNOS→NO→SNO-Src→p-Src→p-NR2B→NMDA-nNOS” signaling amplification cycles may be the molecular basis of NR2B tyrosine phosphorylation upward positive feedback. We shall examine the alterations of above mentioned signaling amplification cycles in LID rat models. According to the binding site of Src and NR2B, small peptide Tat-Src (40–58) was synthesized and previously shown to block the interaction of Src with the NMDA receptors and inhibited NR2B phosphorylation. Based on these thought, by using Tat-Src (40–58), we evaluated its inhibiting action on the Src•PSD-95•NR2B signaling complex assemble, NR2B phosphorylation and above mentioned signaling amplification cycles in LID rat models, in order to provide new target for clinic treatment of dyskinesia.

前期研究发现Src•PSD-95•NR2B信号复合体异常组装导致Src介导NR2B酪氨酸磷酸化正反馈上调是异动症发生的分子基础。Src自身磷酸化是Src催化NR2B磷酸化的重要环节。研究显示NMDA→Ca2+→Ca2+.CaM或PKC→p-Pyk2→p-Src→p-NR2B→NMDA与NMDA-nNOS→NO→SNO-Src→.p-Src→p-NR2B→NMDA-nNOS信号放大循环可能是Src介导NR2B磷酸化正反馈上调的具体信号途径。我们将在异动症模型中明确上述信号循环的异常作用，并根据Src和NR2B的结合位点，合成了与此位点共轭的小肽Tat-Src，期望以此竞争性干扰Src和NR2B的直接结合，从而抑制Src对NR2B的激活，并通过体内实验验证Tat-Src对Src•PSD-95•NR2B信号复合体的组装、NR2B磷酸化及上述信号循环的抑制作用，为探索异动症治疗的新途径提供理论依据

前期我们研究发现Src•PSD-95•NR2B信号复合体异常组装导致Src介导NR2B酪氨酸磷酸化正反馈上调是帕金森病异动症发生的分子基础。Src自身磷酸化是Src催化NR2B磷酸化的重要环节。研究显示nNOS或Ca2+.CaM或PKC信号通路可能介导Src的自身磷酸化进而促进NR2B磷酸化上调的具体途径。我们在异动症模型中明确了上述信号通路的重要作用。发现nNOS特异性抑制剂7-NI能上调p-nNOS-S847，抑制nNOS/NO激活,同时抑制了Src的S硝基化及自身磷酸化（SNO-Src/p-Src）与NR2B的酪氨酸磷酸化；NR2B拮抗剂CP-101,606亦能上调p-nNOS-S847，抑制SNO-Src/p-Src与NR2B的酪氨酸磷酸化。这些数据表明nNOS信号参与Src的激活及NR2B的功能调控。Ca2+.CaM特异性抑制剂W7（N-氨乙基-5-氯-1-磺胺酰萘）、PKC特异性抑制剂(Chelerythrine chloride) 亦可抑制p-Pyk2与p-Src。鉴于Src和NR2B这种密切关系，根据Src和NR2B的结合位点，合成了与此位点共轭的小肽Tat-Src，竞争性干扰Src和NR2B的直接结合，从而抑制Src对NR2B的激活，并通过体内实验证实了Tat-Src可改善异动症模型的行为学，抑制Src和NR2B的结合量，并进而抑制SNO-Src/p-Src与NR2B的酪氨酸磷酸化水平，为探索异动症治疗的新途径提供了理论依据。在此基础之上，我们发现rTMS能减轻运动并发症模型鼠行为学异常，保护模型鼠黒质多巴胺能神经元，促进黒质胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）分泌，减轻模型鼠纹状体部位多巴胺水平的波动，抑制NR2B的酪氨酸磷酸化水平。因此，我们明确了临床神经康复手段rTMS的治疗效果和机制，为其进一步应用提供了理论基础。