SOCs在乙醇诱导的肝细胞钙超载中的作用及其调节

The incidence of alcoholic liver diseases(ALD) in our country has increased markedly and alcohol has become the second largest etiological factor of liver diseases while the first one is viral hepatitis.However,the pathogenesis of alcoholic liver disease still remains obscure so far,so there is no any specific and effective treatment for ALD.This project previously found that with establishing the models of chronic alcoholic liver diseases on rats,ethanol-induced Ca2+ overload may be related to mitochondria and hepatocytes injury.In preliminary experiments,we found that ethanol exposure may increase the expression of store-operated Ca2+ channels(SOCs) in HepG2 cells,which may be related to Ca2+ overload and injury of hepatocytes for the first time.In order to investigate the role of SOCs in the ethanol-induced primary hepatocytes calcium overload and ethanol-induced influx of extracellular Ca2+ and the regulatory mechanism of SOCs from the overall - cell - molecule levels,we will replicate the in vitro model of chronic ethanol induced primary hepatocyte injury and the in vivo rat model of alcoholic liver diseases,and make use of the technologies of molecular biology, flow cytometry, RNA interference.Futher more,the intervention effect of Ca2+ channel specific blockers on ethanol-induced hepatocytes injury will be observed to elucidate the signal pathway and molecular mechanism of ALD and provide experimental basis for finding a new target of the clinical treatments of alcoholic liver diseases.

酒精性肝病（ALD）已渐成为我国继病毒性肝病之后的第二大肝病，但其肝损伤机制仍不明确，因而其治疗缺乏特异性及有效性。本课题组前期通过建立ALD大鼠模型，发现乙醇诱导肝细胞钙超载与线粒体及肝细胞损伤有关，并在本项目的预实验中在HepG2肝癌细胞系中首次证实了酒精刺激下钙池操纵的钙离子通道（SOCs）表达增加与肝细胞钙超载及损伤有关。为探明正常肝细胞是否遵循上述机制而致肝损伤及SOCs开放的调节机制，本课题拟复制乙醇诱导的体外原代肝细胞损伤模型及体内ALD模型，采用分子生物学、流式细胞仪、RNA干扰等技术，从整体-细胞-分子三个层次，揭示酒精刺激下SOCs的开放对肝细胞钙超载的影响及其调节机制，并同时观察特异性钙通道阻断剂在此过程中的干预作用，以阐明ALD发生的信号传导通路及分子机制，为其防治提供新靶点。

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是由于长期过量饮酒所致的慢性疾病, 随饮酒量的增加及饮酒史的延长而逐渐表现为脂肪肝→酒精性肝炎→酒精性肝纤维化→酒精性肝硬化等。ALD已渐成为我国继病毒性肝病之后的第二大肝病，但其肝损伤机制仍不明确，因而其治疗缺乏特异性及有效性。本课题组前期通过建立 ALD 大鼠模型，发现乙醇诱导肝细胞钙超载与线粒体及肝细胞损伤有关，并在本项目的预实验中在 HepG2 肝癌细胞系中首次证实了酒精刺激下钙池操纵的钙离子通道（store-operated calcium channels, SOCs）表达增加与肝细胞钙超载及损伤有关。为探明正常肝细胞是否遵循上述机制而致肝损伤及 SOCs 开放的调节机制，本课题通过复制乙醇诱导的体外原代肝细胞损伤模型及体内 ALD 模型，采用分子生物学、流式细胞仪、RNA 干扰等技术，从整体-细胞-分子三个层次，揭示了酒精刺激下 SOCs 的开放对肝细胞钙超载的影响及其调节机制，并同时观察特异性钙通道阻断剂在此过程中的干预作用，以阐明 ALD 发生的信号传导通路及分子机制，为其防治提供新靶点。相关研究结果如下：（1）在正常肝细胞中及体内试验中，乙醇可浓度依赖性的降低肝细胞的存活率，升高培养基上清及血清中转氨酶的水平，并增加了胞浆中游离钙离子的浓度；同时乙醇可明显的增高 SOCs相关蛋白分子 STIM1、Orai1 的基因及蛋白表达，说明 SOCs可能参与乙醇诱导的肝细胞钙超载及损伤。（2）体内外实验均发现：与乙醇刺激组相比，SOCs阻断剂及 sh-RNA 干扰后，可明显的降低胞浆中游离钙离子的浓度，升高细胞存活率，并降低转氨酶的水平，且各阻断剂之间没有显著地统计学上的差别，进一步证实了SOCs在乙醇诱导肝细胞钙超载中的作用，进一步说明了 SOCs可能在乙醇导致的肝细胞的损伤中发挥作用。（3）在体外实验中发现：EC50浓度（100mM）的乙醇明显增加了线粒体内膜上的 Ca2+单向转运体（MCU）的基因及蛋白的表达量；与乙醇刺激组相比，MCU通道剂特异性抑制剂（Ru360）处理可升高细胞存活率，增加ATP的生成，从而使依赖ATP的内质网 Ca2+-ATP 酶（SERCA）活性增加，减少胞外钙离子通过SOCs的内流，进一步明确MCU、SERCA可能在酒精刺激导致SOCs持续开放中发挥作用。