CRISPR/Cas9系统介导的可逆性永生化人脐静脉内皮细胞模型的研究

The biggest hamper of primary cell models is their limited life span in vitro. Simian Virus 40 large T antigen could immortalize primary cells by binding and inactiviting Rb and P53, the tumor-suppressors. But the existence of this proto-oncogene in the transformed cell proved to be a severe concern about its carcinogenesis and the immortalized cells differ from the primary ones phenotypically and functionally. The CRISPR/Cas9 technology is a simple two-component system in which changes in the guide sequence of the sgRNA program Cas9 to target any DNA sequence of interest, which has triggered a revolution in bio-medical science all around the world. Constructs of different combination of SV40LT, Cas9 and CRISPR-Sv40LT will be established and then will be transfected into the human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). The SV40LT gene in the immortalized HUVEC could be removed by CRISPR. The primary/transformed/reversed HUVEC would be intensive characterized and compared, and the mechanism would be explored. This project would expand the application field of CRISPR technology. Also the reversible Cas9-SV40LT immortalization system and the reversible immortalized vascular endothelial cell model would be more valuble and have a bright application prospect.

猿猴病毒大T抗原(SV40LT)可结合并失活p53、Rb等进而诱导细胞永生化，我们13年建立了SV40LT转化的人脐静脉内皮细胞HUVEC-T1，公开后已被使用200余次。但转化后细胞内该原癌基因长期存在具有潜在致癌危险性，且转化细胞的表型及功能与原代细胞相比也具有一定差异。CRISPR系统是近年出现的一个简便准确高效的基因操作工具，在向导RNA的引导下，Cas9蛋白可准确切除基因组中靶向序列。本课题拟在SV40LT诱导原代人脐静脉内皮细胞永生化的基础上，明确CRISPER系统是否可以特异切除外源导入的基因（SV40 LT）；同时对原代/永生化/回复后细胞模型进行比较，研究切除SV40LT是否可以使细胞永生化过程中发生改变的Rb/p53通路得到完全恢复，进而得到更接近天然的血管内皮模型；另外，Cas9-SV40LT这一可逆性诱导永生化系统和所建立的内皮细胞模型均具有非常可观的应用前景。

本研究首先进行了人脐静脉内皮HUVEC的原代培养及传代，新构建了Cas9-IRES-LT共表达载体；然后探索了两步法（先转染SV40LT后转染Cas9）及一步法（转染Cas9-IRES-LT共表达载体）建立同时表达SV40LT和Cas9的转化人内皮细胞系， 获得了HUVEC-CT；验证了转染后细胞增获得了永生化（已传38代），用PCR/RNA-seq/WB方法证明在DNA/RNA/蛋白水平表达SV40LT和Cas9； Lectin 结合等证明细胞保持内皮特性。进一步，用CRISPR系统切除永生化基因SV40 LT，证明切除LT后内皮细胞增殖下降，发生了基因表达谱改变，Matrigel管型、内皮标记CD31、CD34等方面，是优化的血管内皮细胞模型。同时，本研究构建的Cas9-IRES-LT共表达载体，可用于建立各种同时表达Cas9和SV40 LT的其他细胞模型；而HUVEC-CT细胞系，可设计针对各种靶基因的寡核苷酸sgRNA，用CRISPR/Cas9技术进行各种靶基因的编辑进而研究其在内皮细胞中的功能，为内皮相关疾病研究提供了更省时省力的研究模型。实验过程中各阶段的细胞，已被国家生物医学实验细胞资源库接受，并开展共享使用。