CRISPR/Cas9介导的热带爪蛙基因标记技术及模型建立

Xenopus tropicalis is an ideal model animal to construct human disease model, because it has real genetic background of diploid and is evolutionally closer to human compared with zebrafish. CRISPR/Cas9 system has developed to a simple and effective technology for genom editing. However, CRISPR/Cas9-mediated targeted integration of exogenous DNA fragments are still far from satisfactory. Our previous study indicated that a novel design of donor plasmid containing 2 bait sequences and a 3’UTR from endogenous target gene can efficiently and precisely label target gene in mammalian cells. Based on our previous study, we further hypothesize that the novel design of donor plasmid based on 2 baits and the 3’UTR from endogenous target gene will significantly increase the efficiency of CRSPR/Cas9-mediated gene labeling in Xenopus tropicalis. Therefore, this project will further optimize the strategy of donor plasmid design, and elucidate the molecular mechanism by which the novel strategy for donor plasmid based on 2 baits and the 3’UTR increase CRISPR/Cas9-mediated gene labeling in Xenopus tropicalis, through microinjection, in vivo imaging, genotyping, DNA sequencing, and germline transmission and so on. Through this project, we will establish the efficient and precise technology for target gene labeling in Xenopus tropicalis, thereby promoting the development of human disease model.

热带爪蛙拥有二倍体遗传背景且进化上较斑马鱼更接近人类，是建立人类疾病模型的理想模式动物。Cas9系统是进行基因敲除的一种简单有效的最新基因编辑技术，但利用该技术进行基因标记的研究则相对滞后。我们前期系列研究表明，通过对供体（donor）载体进行优化设计，建立基于双钓饵（bait）及靶基因3’UTR的donor载体系统，能对哺乳动物细胞中的靶基因进行精准标记。在上述工作基础上，我们进一步提出“通过构建基于双bait及内源靶基因3’UTR的donor载体系统，能有效提高Cas9介导的热带爪蛙基因标记效率”的研究假想。本项目将通过对donor载体的设计与优化，利用Cas9及显微注射技术，结合活体成像、基因型鉴定、测序及生殖传递检测等组合技术手段，阐明双bait及3’UTR促进基因标记效率的分子机制，并建立起高效精准的热带爪蛙基因标记及模型构建技术，为人类疾病模型研发提供理论依据及技术手段。

热带爪蛙（Xenopus tropicalis）是拥有二倍体遗传背景的两栖类模式动物，是建立人类疾病模型的理想模式动物。CRISPR-Cas9系统是进行基因敲除的一种简单有效的第三代基因编辑技术，但该技术在热带爪蛙基因标记领域的应用则相对滞后。本项目将通过增加钓饵（bait）对donor载体进行优化设计，利用Cas9及显微注射技术，结合活体成像、基因型鉴定、测序及生殖传递检测等组合技术手段，以热带爪蛙的myh6基因为研究对象，重点开展了以下研究：（1）靶向热带爪蛙myh6基因座的sgRNA的设计与优化研究；（2）基于双bait及3’UTR的donor载体设计、优化及热带爪蛙基因标记效率研究；（3）双bait及3’UTR介导热带爪蛙基因标记的生殖传递能力检测。我们的上述研究表明：（1）基于单bait（1BCas系统）及双bait（2BCas系统）的donor载体，结合CRISPR-Cas9技术，均能有效标记热带爪蛙的靶基因；（2）相对于1BCas系统而言，2BCas系统在标记靶基因的同时，能有效去除donor载体中的非必须DNA元件，能更加精确的标记靶基因；（3）利用内源性靶基因的3’UTR替换donor载体中poly A元件，能有效促进标记后靶基因的表达水平。我们的上述研究结果初步阐明了双bait及3’UTR促进基因标记效率的分子机制，并建立起高效精准的热带爪蛙基因标记及模型构建技术，为人类疾病模型研发提供理论依据及技术手段。