NSP5蛋白与宿主细胞beta tubulin相互作用对PoRV致病性的影响

Rotavirus (Rotavirus, RV) is the major pathogen causing diarrhea in infants and piglets. Although the research on RV is increasing, many aspects of the pathogenic mechanism of RV is still unclear. PoRV non-structural protein 5 (NSP5) is a highly phosphorylated protein, has RNA binding activity, plays a key role in the assembly of virus particles. Study on the interaction of NSP5 protein and the host cell, can deepen understanding of the pathogenic mechanism of PoRV. Interaction between PoRV NMTL strain NSP5 protein and beta tubulin was found. Based on the interaction, we want to 1) down-regulation or up re-gulating the expression of beta tubulin and analysis of the impact on PoRV replication in host cells; 2) through expression the truncated NSP5 protein and site directed mutagenesis, finding the interaction can site between NSP5 protein and beta tubulin; 3) rescue the virus deletion or mutation of NSP5 and beta tubulin interaction region to analysis of biological characteristics of the recombinant virus. The aim of this research is to reveal the NSP5 and beta tubulin interaction influence on PoRV replication, which provides a new way for the pathogenic mechanism of PoRV.

轮状病毒(Rotavirus，RV)是引起婴幼儿和多种幼龄动物病毒性腹泻的主要病原体。虽然关于RV的研究日益深入，但RV致病机理的许多方面仍然不清楚。猪轮状病毒(PoRV) NSP5是一个高度磷酸化的蛋白，在病毒颗粒装配中起到关键作用。本项目拟在发现PoRV NMTL株NSP5蛋白与beta tubulin相互作用的基础上，1）通过上调和下调beta tubulin表达，分析beta tubulin对PoRV在宿主细胞内复制的影响；2）通过对NSP5蛋白截短表达及定点突变，寻找NSP5蛋白与beta tubulin相互作用位点；3）通过反向遗传学技术拯救NSP5与beta tubulin相互作用区域缺失或突变的重组病毒，对重组病毒的生物学特性进行分析，以揭示NSP5与beta tubulin相互作用对PoRV的复制的影响，进而为深入了解PoRV致病机制提供新途径。

仔猪轮状病毒性腹泻是由猪轮状病毒(Porcine rotavirus，PoRV)引起的一种以腹泻、呕吐、脱水为特征的传染病。PoRV感染导致仔猪死亡给养猪业造成严重的经济损失。非结构蛋白NSP5在病毒颗粒的装配中起到关键作用，通过对NSP5蛋白与宿主细胞蛋白相互作用的深入研究，将有助于对猪轮状病毒复制机制和致病机理的深入理解。.为了鉴定宿主细胞中与NSP5相互的宿主蛋白，应用纯化的GST-NSP5与制备的宿主细胞蛋白进行孵育，结合质谱鉴定的方法，鉴定出宿主细胞β-tubulin能够与病毒蛋白NSP5相互作用。.体内和体外验证病毒蛋白NSP5与宿主细胞蛋白β-tubulin之间的相互作用。体内实验表明，应用NSP5的单克隆抗体能够沉淀出宿主细胞的β-tubulin蛋白。体外实验表明，双质粒转染后进行免疫共沉淀轮状病毒NSP5蛋白与宿主细胞的β-tubulin蛋白存在相互作用。.为了进一步分析NSP5与β-tubulin的定位情况，在病毒感染细胞中以及双质粒共转染的细胞中均发现NSP5和β-tubulin共定位于细胞质中。病毒感染细胞后，细胞中β-tubulin从微管上解聚，微管骨架变得稀疏松散。 .通过上调表达β-tubulin和下调表达β-tubulin分析β-tubulin对PoRV复制的影响。实验结果表明β-tubulin上调表达能够明显抑制PoRV NSP5和VP6蛋白的合成与表达，β-tubulin能够抑制PoRV复制。下调表达β-tubulin后能够促进PoRV复制。.为了进一步分析β-tubulin与病毒复制的关系，本研究引入诺考达唑、ABT-751以及紫杉醇三个β-tubulin靶标药物分析对PoRV复制的关系。实验结果表明诺考达唑能够促进PoRV复制，ABT-751促进PoRV复制，紫杉醇能够抑制PoRV复制，研究结果表明β-tubulin对PoRV复制具有负调控作用。.通过本课题研究，达到最初预订目标：确定了PoRV病毒蛋白NSP5与宿主细胞β-tubulin存在相互作用； PoRV感染诱导宿主细胞β-tubulin从微管上解聚，并形成与NSP5共定位的颗粒状β-tubulin，β-tubulin对PoRV毒株的复制呈现负调控作用。.本课题研究成果：发表相关研究论文8篇，培养研究生4名。