牧草盲蝽对三氟氯氰菊酯抗性相关P450基因的鉴定及功能分析

Transcriptome analysis and Cytochrome P450-mediated function research on pyrethroid resistance will be studied on Apolygus pratensis Linnaeus, which are key insects, occurred on important economic crop alfalfa Medicago sativa Linn in Inner Mongolia region. After consecutively selected for 11 generations in lab, a lambda-cyhalthorin resistant A. pratensis strain (24 fold) was obtained. The synergism results showed that enzyme activity increasing of mixed-functional oxidase (MFO) would lead to lambda-cyhalthorin resistance. To further study resistance mechanism, our subject is planned to adopt the RNA-seq technology to analyze differentially expressed genes of resistant and susceptible Apolygus pratensis L. in transcriptional level, we aim to clone significantly up-regulated Cytochrome P450 cDNA, study expression difference and gene function by RNAi and bioassay, P450 content and expression level detection to explore function of P450 genes, which lay the theoretical foundation for fully elaborating P450-mediated molecular mechanism of pyrethroid resistance on Apolygus pratensis L.

本项目针对内蒙古地区重要经济作物，紫花苜蓿Medicago sativa Linn上的害虫——牧草盲蝽Apolygus pratensis Linnaeus进行三氟氯氰菊酯抗性的转录组分析及与抗性相关细胞色素P450基因的鉴定与功能研究。经过室内11代连续筛选，获得了24倍的抗性牧草盲蝽品系，增效试验判定：多功能氧化酶（Mixed-functional oxidase, MFO）的活性升高导致抗性增加。为深入研究抗性机制，本项目拟采用转录组测序技术分析三氟氯氰菊酯抗性牧草盲蝽在转录水平上基因的差异表达情况，并从细胞色素P450入手，通过寻找显著上调的P450基因，克隆基因、构建差异表达谱，并应用RNAi技术结合生物测定，P450含量、表达量测定等，探索P450基因的功能，最终阐述牧草盲蝽细胞色素P450介导拟除虫菊酯杀虫剂抗药性的分子机制。

昆虫细胞色素P450能够参与昆虫体内多种外源物质和内源物质的代谢， 其含量的升高和活性增强是害虫抗药性产生的主要原因之一。为深入探讨细胞色素P450介导的牧草盲蝽Lygus pratensis Linnaeus对菊酯类杀虫剂抗药性的机制， 本课题通过室内抗药性选育，获得了一个抗性倍数为41倍的牧草盲蝽抗性品系，经交互抗性与增效实验验证：该品系抗药性可能与细胞色素P450的代谢能力提高有关。我们进一步利用高通量测序技术开展了不同抗性品系的转录组与蛋白组测序及差异表达分析，通过联合组学研究及差异表达基因与蛋白结果分析：挖掘到一条编码细胞色素P450 CYP6a13蛋白的基因，抗药性品系中该基因在转录和翻译水平上都显示过表达，推测这条基因的功能与抗药性密切相关。由于牧草盲蝽注射技术的不成熟，我们调整了研究策略，构建了牧草盲蝽P450 CYP6a13过表达转基因果蝇品系，通过对转基因品系进行拟除虫菊酯杀虫剂的毒理测定和荧光定量PCR验证等手段，明确该基因在转基因品系中的过表达，且这种过表达直接降低了果蝇对菊酯类杀虫剂的敏感度。按项目书提出的任务计划，完成了牧草盲蝽细胞色素P450 CYP6a13涉及三氟氯氰菊酯抗药性的鉴定与功能分析。.除该项目计划任务外，我们增加了这些研究：牧草盲蝽对常用杀虫剂的抗药性监测、对药剂的亚致死效应研究、不同寄主植物对牧草盲蝽生长发育、繁殖的影响、牧草盲蝽线粒体基因组测序分析、及牧草盲蝽钠离子通道跨膜结构域IIS4-IIS6序列的克隆。旨在广泛、深入地了解牧草盲蝽的生物学特性、发生规律、基因信息等，同时为下一步开展钠离子通道基因突变涉及牧草盲蝽对菊酯类药剂抗性的靶标基因抗性突变机制奠定了基础。.本项目资助目前已发表中文核心论文2篇，SCI论文1篇，待发表SCI论文两篇，中文核心论文1篇，正在撰写SCI论文1篇。培养硕士生2名，其中1名已经取得硕士学位，1名在读。项目投入经费38万元，支出32.60万元，各项支出基本与预算相符，同类项目中部分项目经费做了经依托单位相关部门批准进行了调整。剩余经费5.40万元，剩余经费计划用于本项目研究后续支出。