单环刺螠体节形成和演变的分子基础

Urechis unicinctus is an important commercial marine inverbrate in coast of Yellow and Bohai, China. Formation and development of segment are key processes during larval development and metamorphosis in U. unincinctus and play an important role in evolution of echiura. In this project, we will screen different expression genes and pathways, and put forward the major gene regulatory network during formation, maintenance and disappearance of the segment in U. unicinctus by sequence comparing at transcriptome level among trochophores, somite larvae, worm-like larvae and juveniles. The key genes will be cloned by RACE technique, and their expression characteristics and cellular localization will be determined at RNA and protein level by in situ hybridization and immunohistochemical techniques. Furthermore, the founctions of curcial genes and pathways will be identified by a series of test, such as RNAi, inhibitor blockade, quantitative RT-PCR, Western blot, morphology and histology. Moreover, transcript of the crucial genes will be investigated by cloning their promoters using genome walking method and yeast one hybid, identificating the trancsript factor binding with the promoter using EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) and ChIP (Chromatin immunoprecitation) techniques. Our aims are to elaborate the molecular mechnism on the fromation and development of segment in U. unicinctus and provide some important scientific evidences for studying the molrcular mechnism during U. unicinctus larval metamorphosis and probing the evolution of echiura.

单环刺螠是我国黄渤海沿岸重要的海水经济无脊椎动物，体节形成和演变是单环刺螠幼虫发育和变态过程中的重要事件，并在螠虫动物进化中具有重要意义。本项目将在前期研究的基础上，通过比较单环刺螠担轮幼虫、体节幼虫、蠕虫状幼虫和幼螠的转录组数据，筛选其体节形成、体节维持和体节消失3个重要发育过程中的差异基因和通路，提出主要的基因调控网络；采用RACE、原位杂交和免疫组织化学技术，克隆关键基因的全长cDNA序列并确定它们的表达特征；采用RNA干扰、抑制剂阻断并结合定量RT-PCR、Western blot和形态学、组织学检测，揭示主效基因和主要通路的功能；克隆主效基因的启动子，采用酵母单杂交、凝胶迁移和染色质免疫共沉淀技术研究主效基因的转录调控。本项目将阐述单环刺螠体节形成和演变的分子机制和体节基因在螠虫动物进化中的作用，为深入探讨单环刺螠幼虫变态的分子机制和螠虫动物的进化研究提供科学依据。

螠虫动物发育过程中具有独特地暂时性幼虫分节现象，这是它们不同于其近缘物种环节动物的特征之一。迄今涉及此类特殊体节形成和消失的分子机制是不清楚的，它限制了人们对动物分节现象演化历程和螠虫动物进化地位的认识。本项目以沿海经济螠虫动物——单环刺螠为研究对象，揭示了其幼虫体节形成和演变过程及其相关的关键基因和调控通路。使用特异性抗体确定未来参与体节发生的细胞首先在单环刺螠晚期担轮幼虫下半球腹侧处增殖聚集形成细胞带；至早期体节幼虫，这些细胞增殖带由腹侧向两侧和背侧延伸，同时幼虫体节边界发生，并在体节幼虫表面形成12个完整的幼虫体节；每个体节由体壁单层柱状分泌细胞构成。当晚期体节幼虫向蠕虫幼虫发育时，每个体节中首先产生2-4个小裂缝，然后幼虫体节边界模糊，至蠕虫幼虫体节消失。从单环刺螠幼虫体节形成和演变关键节点幼虫的转录组中共筛选出101个与节肢动物和环节动物体节发生相关的同源基因，多数基因在螠虫动物、环节动物和节肢动物中是保守的，但是果蝇中的一些间隙基因和部分成对控制基因在螠虫动物幼虫转录组中相对较少；揭示了22个体节基因在单环刺螠幼虫中的表达特征，确定多数基因的表达图式类似于环节动物；通过10个中胚层相关基因的表达分析，提出单环刺螠幼虫体节与典型体节结构上的差异可能源于其中胚层早期发育的延迟。使用STEM软件富集到8个信号通路可能与单环刺螠幼虫体节形成和消失相关，其中5个信号通路是首次报道与体节形成相关，构建了维持Hedgehog通路活性的基因调控网络。通过蛋白抑制和激活实验，确定单环刺螠幼虫体节边界界定为保守的Hedgehog-Wnt模型。构建了单环刺螠幼虫RNAi体系；使用该体系确定Hox家族基因参与单环刺螠幼虫体节发生，其空间共线性表达模式不采用果蝇中的后部抑制机制；敲降Msx（按体节表达）在早期体节幼虫中的表达，未见其幼虫体节发生异常，但幼虫神经系统发育缺陷。本项目成果为深入探讨螠虫动物个体发育的分子机制、动物分节现象的演变历程等提供科学依据。