参与单环刺螠应对环境硫化物的重要信号通路鉴定和功能分析

Signaling pathways play important roles in passing environmental changes, regulating and controling phsiological reaction, growth and development of organisms. It has been revealed in our previous research that Urechis unicinctus, a coastal commercial animal has the characteristics of oxygenizing sulfide. However, it is still unknown so far how the signaling pathways participate in regulating the metabolism of sulfide in U. unicinctus. In this project, we will try to illuminat funcions of the key proteins in signaling pathways on sulfide metabolism in U. unicintus using a serial of techniques of molecular biology based on our preliminary studies. (1). Screen the key signaling pathways of sulfide metabolism using RNA-seq sequencing technique; (2). Clone the full-length cDNA of the key signaling molecules from MAPKs pathway, NF-kB pathway and apoptosis pathway using RACE amplification; (3). Reveal their characteristics of the expression dynamics in U. unicinctus exposed to sulfide using real-time PCR technique. (4). Investigate these target molecular functions at intigration and cell levels when the worm exposed to sulfide using Western blot, ELISA, pull-down and Co-immunoprecipitation techniques. It is expected in this project to reveal the synergy relation among the signaling pathways for the sulfide metabolism, and provide a new understanding in the regulation of sulfide metabolism from signaling pathways.

信号通路在传递环境变化的信息、调节和控制生物的生理反应与生长发育过程中起到了重要的作用。我们过去的研究已经揭示沿海经济动物单环刺螠具有氧化代谢硫化物的特性，然而信号通路是如何调控单环刺螠的硫化物代谢，迄今国内外的认知尚为空白。本项目我们将在前期研究的基础上，采用高通量测序技术筛选单环刺螠参与硫化物代谢的关键信号通路；进而以MAPKs、NF-kB、apoptosis通路为重点，采用RACE技术克隆3个通路中的重要信号分子全长cDNA；定量RT-PCR技术揭示目的分子在硫化物应急下单环刺螠主要组织中的表达动力学特征；在整体和细胞水平并结合Western blot、ELISA、pull-down和Co-ChIP等技术研究目的分子在单环刺螠应对硫化物过程中的作用。本项目将揭示目的信号通路在硫化物代谢过程中的协同作用关系，有望在生物硫化物代谢的信号通路调控方面取得创新性成果。

生物体内的硫化物既可内源性合成，也可通过体外渗透进入。内源性硫化物作为一种信号分子参与细胞的生理过程，而外源性硫化物则是众所周知的环境毒物，通常会导致机体的代谢损伤甚至死亡。一些海洋无脊椎动物被发现可以在富硫环境中生存，并且呈现多样的耐受和解毒硫化物机制。本项目我们解析了沿岸耐硫螠虫动物单环刺螠在应答环境硫化物暴露中的主要基因通路。首次报道核糖体、补体系统和蛋白酶体等参与了单环刺螠耐受和应答环境硫化物的暴露。确定JNK信号通路是单环刺螠应对硫化物暴露的关键通路，ERK信号通路可能参与了单环刺螠早期应对硫化物暴露的过程，而p38在单环刺螠应对硫化物暴露中的作用不明显。确定硫化物可激活单环刺螠呼吸肠组织细胞中的NF-κB信号通路；当低浓度硫化物暴露时，活化的NF-κB可以通过上调Bcl-xL的表达，引发抗凋亡反应以抑制凋亡通路中Caspase相关分子的作用，从而避免机体的损害；当高浓度硫化物暴露时，NF-κB介导的Bcl-xL抗凋亡通路未起明显的作用，此时Bax介导的促凋亡途径被启动，并引起组织细胞的损伤。揭示了硫化物应激条件下，单环刺螠的糖酵解通路和氧化磷酸化被抑制，单环刺螠通过上调PIDD基因的表达，并与NF-κB通路和细胞凋亡通路协作降低硫化物对机体组织细胞的损伤。此外，本项目研究了调控线粒体硫化物氧化解毒关键酶硫醌氧化还原酶基因sqr转录的主要转录因子及其作用。首次发现并验证了一种sumo分子RWDD1蛋白可以作为转录因子与单环刺螠sqr转录高活性区序列结合并激活其转录。确定转录因子NF1和Sp1是非应激状态下细胞中sqr转录调控的主要转录因子；HSF1是细胞硫化物应激下sqr转录调控的重要转录因子；HSF1、NF1和Sp1作为相互协调的转录因子，共同参与激活单环刺螠sqr转录活性，在单环刺螠耐受硫化物暴露中发挥重要作用。本项目研究成果为人们揭示生物耐受和代谢硫化物的分子机制以及认知富硫化物环境中的生命现象提供了重要的科学证据。