小鼠Orexin 2型受体的二聚化及信号转导途径的研究

Orexin 有促进食欲、参与能量平衡、增强胃酸分泌及糖皮质激素释放的作用，并参与生殖功能、心血管活动和睡眠觉醒周期的调节。前期实验鉴定了小鼠G蛋白偶联受体即Orexin 2型受体（mOX2R）C末端选择性剪接产生的两个受体（mOX2αR 和mOX2βR）。当mOX2αR 和mOX2βR共表达时，表现为Orexin诱导的细胞外信号调节激酶（ERK1/2）磷酸化显著增强。实验证明，这两个受体之间存在相互作用，以异源二聚体形式存在，并对相应激动剂的亲和力和信号转导等有影响。本项目采用分子克隆、生物发光共振能量转移、基因突变、共聚焦显微镜、免疫共沉淀、免疫印迹及放射配体结合实验等技术,系统地对两个受体之间进行异源二聚化和信号转导途径的研究。旨在阐明受体-受体之间不同的生理、 病理功能和相互作用机制。研究结果将有助于揭示相关疾病发生的分子机理，探寻相关疾病治疗的新突破点及新药开发。

Orexin 有促进食欲、参与能量平衡、增强胃酸分泌及糖皮质激素释放的作用，并参与生殖功能、心血管和睡眠觉醒周期的调节，还在发作性睡病和抑郁症中发挥重要的作用。前期实验鉴别了小鼠G -蛋白偶联受体即Orexin 2型受体（mOX2R）C末端选择性剪接产生的两个受体（mOX2αR 和mOX2βR）。本研究中，我们探讨了mOX2αR 和mOX2βR形成异源二聚化的可能性，并探讨二聚化在激动剂Orexin-A/-B刺激后对信号转导途径的影响。利用共聚焦显微镜和酶联免疫吸附试验（ELISA），证明mOX2αR 和mOX2βR在细胞膜质膜上共表达。利用免疫共沉淀（Co-IP）和生物发光共振能量转移（BRET）检测mOX2αR 和mOX2βR能形成异源二聚体。构建过表达重组mOX2αR 和mOX2βR的细胞系，Orexin-A/-B刺激后发现ERK1 / 2磷酸化增加，且表现为剂量和时间依赖性，在5 min和100nM时其活性最大。此外，Orexin-A/-B快速升高细胞内Ca2 +，然后细胞内Ca2 +缓慢下降，最后达到一个较稳定水平，同时研究表明蛋白激酶C抑制剂（RO-31-8220）可以显著抑制Ca2+的释放。随后的实验证明，cAMP反应元件（CRE）的活性显著降低，而血清反应元件（SRE）的荧光素酶和T-淋巴细胞活化的核因子应答元件（NFAT-RE）活性显著增强。与对照相比，Orexin-A/-B提高了HEK293-mOX2αR/mOX2βR细胞系的增殖。总之，我们首次证明mOX2αR 和mOX2βR能形成异源二聚体，且mOX2αR 和mOX2βR二聚化能增强PKC活性和降低PKA活性，并通过ERK信号通路对细胞的增殖有促进作用。这对不同的生物活性的翻译调控，如食物摄入量的调节，具有重要的意义。