烟碱去甲基化酶基因表达调控机制研究

降烟碱是烟草中致癌物质烟草特有亚硝胺（TSNAs）的主要前体物，降烟碱主要来源于烟碱去甲基化过程，此过程由烟碱去甲基化酶CYP82E4负责，因此，抑制CYP82E4表达可以有效抑制烟碱去甲基化过程，减少降烟碱合成，降低烟草中TSNAs含量，但目前CYP82E4表达调控机制并不清楚。我们前期研究发现一株高烟碱转化率突变体，该株系同时具有烟碱去甲基化活性与花瓣变白的表型，推测其突变基因为CYP82E4的上游调控序列。本项目拟以此突变体为材料采用抑制性消减杂交及RT-PCR技术分离该突变基因，采用RNAi及过表达等方法研究新基因对CYP82E4表达调控机制，同时利用GFP与GUS蛋白融合技术揭示新基因的时空表达模式。本项目完成将首次阐明CYP82E4的表达调控机制，进一步揭示烟碱去甲基化代谢途径，为利用基因工程抑制降烟碱合成提供依据和理论基础。

烟碱去甲基化（烟碱转化）是白肋烟中烟草特有亚硝胺（Tobacco-specific nitrosamines, TSNAs）产生的重要途径之一。该项目通过对高烟碱转化突变体（High nicotine conversion mutant, hnc）与其低烟碱转化对照材料（Low nicotine conversion, lnc）在转录组、蛋白质组及代谢组水平系统研究，在转录水平获得19个具有全长CDS序列的差异/特异表达基因，在蛋白水平获得了12个与烟碱代谢相关的蛋白质表达具有显著差异，同时获得了一批差异代谢物，对于系统揭示烟碱去甲基化的分子机制以及全面解析烟碱代谢途径具有重要意义；同时，该项目对烟碱去甲基化酶基因CYP82E4时空表达差异性研究，以及乙烯等外界因子对该基因表达诱导分析，阐明了CYP82E4基因表达规律及其外界响应因子，明确了转录调控因子的筛选目标为乙烯响应因子；为了进一步阐明烟碱去甲基化代谢的分子调控机制，项目组以hnc和lnc烟草叶片为材料构建了酵母单杂交文库，对CYP82E4启动子核心序列进行筛选，目前已初步确定CYP82E4基因启动子上游调控区与转录因子的可能结合序列，下一步将利用该序列对酵母单杂交文库筛选CYP82E4基因的转录因子，进一步解析烟碱去甲基化酶基因表达调控的分子机制，为调控烟碱转化过程提供新的靶标基因。