持续性感染相关的杆状病毒基因筛选

在昆虫种群中常常发生杆状病毒持续性感染，持续性感染可转变为增殖性感染而引发病毒流行病。其分子发生机制尚不清楚。在前期工作中，我们首次建立了甜菜夜蛾核多角体病毒（SeMNPV）持续性感染Se301的细胞株，并从中分离得到一株不产生子代病毒、但对SeMNPV的感染具有抑制作用的细胞克隆株，为揭示杆状病毒持续性感染的分子机理提供了理想的研究材料。本项目拟以该持续性感染细胞为研究对象，利用抑制性消减杂交和差异蛋白组学技术，分离筛选持续性感染细胞中差异表达的病毒基因。同时，通过瞬时表达和RNA干涉等方法，识别和鉴定影响杆状病毒持续性感染的病毒基因。本项目的研究将有助于揭示杆状病毒持续性感染和激活的分子机理，也为田间更好地利用杆状病毒长期控制害虫种群提供重要的理论依据。

在昆虫种群中常常发生杆状病毒持续性感染，持续性感染可转变为增殖性感染而引发病毒流行病。在前期工作中，我们首次建立了甜菜夜蛾核多角体病毒（SeMNPV）持续性感染Se301的细胞株，并从中分离得到一株不产生子代病毒、但对SeMNPV的感染具有抑制作用的细胞克隆株P8-Se301-C1。本项目即利用RNA-Seq测序和差异蛋白组学技术，比较了该SeMNPV持续感染的P8-Se301-C1细胞和健康Se301细胞的差异表达情况，筛选和鉴定了持续性感染细胞中杆状病毒基因和差异表达蛋白。研究获得以下结果：. （1）利用Illumina RNA-seq技术，对P8-Se301-C1细胞和健康Se301细胞转录组体外组装分析，分别获得54,569,296 和56,865,504的raw reads，112,565和102,996的final unigenes。对两个细胞的表达谱进行比较分析，P8-Se301-C1细胞中有151个基因下调（P<0.05），131个基因上调（P<0.05）。利用GO和KEGG对差异表达基因进行了功能注释。. （2）转录组比较及RT-PCR分析验证表明，P8-Se301-C1细胞中含有se5, se7, se8, se12, se43, se45, se89, se90, se124和se126等杆状病毒基因的转录本，且Se301细胞中未检测到。RACE分析表明，在杆状病毒持续感染细胞中，se90和se126基因等可能与宿主基因整合。. （3）利用双向电泳技术对P8-Se301-C和Se301细胞总蛋白进行差异蛋白组分析比较，MALDI-TOF/TOF 质谱技术对差异蛋白进行鉴定。共获得16个上调蛋白点和15个下调蛋白点，质谱分析获得了11个上调蛋白点和10个下调蛋白点的鉴定结果，这些蛋白主要与宿主免疫、代谢等相关。. （4）通过RANi和瞬时表达对持续感染细胞中存在的杆状病毒基因以及差异表达宿主基因的功能进行了初步研究。. 本项目研究提供了健康甜菜夜蛾昆虫细胞和杆状病毒持续感染细胞转录组的有效数据，研究结果对揭示杆状病毒持续性感染机制具有重要的指导意义。