穿膜肽TAT蛋白运载aFGF穿透眼球屏障及其作用机理研究

酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)作为一种神经营养因子，具有潜在治疗视网膜缺血再灌注损伤的功能。然而受血-眼屏障、血浆蛋白结合等因素影响，直接局部滴用以及全身给药aFGF，不能在视网膜达到有效的药物浓度。来源于人类免疫缺陷病毒的TAT蛋白，能携带不同"货物分子"跨膜递送进入多种细胞及生物屏障结构。我们在前期的研究中发现，以TAT蛋白作为载体能够穿透眼球屏障成功地运载aFGF从眼表面进入视网膜，并有效降低缺血再灌注对大鼠视网膜的损伤。然而，TAT携带aFGF穿透眼球屏障的通路以及作用机理尚未被阐明。据此，我们将分别滴用和颈部静脉注射TAT-aFGF融合蛋白，对比评价它们对大鼠视网膜缺血再灌注的疗效；并以TAT作为载体携带绿色荧光蛋白（GFP），考察TAT介导生物大分子穿透眼球屏障的通路；最后在细胞水平上研究其跨膜作用的机理，为开创临床眼底疾病的给药途径和新制剂研制提供有利参考。

酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）作为一种神经营养因子，具有潜在治疗视网膜缺血再灌注损伤的功能。然而受血-眼屏障、血浆蛋白结合等因素影响，直接局部滴用以及全身给药aFGF后，不能在视网膜达到有效的药物浓度。在本课题中，我们利用来源于人类免疫缺陷病毒的TAT蛋白携带aFGF用于治疗视网膜缺血再灌注损伤。首先我们使用大肠杆菌表达了课题需要使用的6种融合蛋白，成功制备了相应的滴眼液。接着，我们通过免疫组化法确证了TAT蛋白能分别携带aFGF和naFGF从眼球角膜进入视网膜组织。为了考证TAT携带蛋白大分子从眼球表面进入眼底的路径，我们以绿色荧光蛋白（GFP）作为报告蛋白，发现穿膜肽TAT可能介导生物大分子穿透角膜，进一步通过房水渗透到眼底视网膜组织。在大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型中，我们证实了TAT-aFGF以及非促分裂改构体TAT-naFGF均能有效治疗大鼠视网膜缺血再灌注损伤，其保护作用是通过减少缺血再灌注在视网膜中引起的氧化应激和内质网应激反应，减少巨噬细胞在视网膜中的浸润从而降低炎症，最终减少视网膜细胞凋亡实现的。而且由于TAT-naFGF去除了促血管增殖的作用，降低了TAT-aFGF促进视网膜新生血管增生的风险，在临床应用特别是对于糖尿病视网膜病变的治疗更具有优势。最后，由于炎症反应在视网膜缺血再灌注损伤的发生发展中具有重要作用，我们进一步评估了具有抗炎作用的姜黄素类似物对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的药效，提出联合应用姜黄素类似物以及TAT-aFGF具有更好疗效，为临床进一步的应用提供理论依据。