基于iTRAQ定量蛋白质组学技术研究镍活化CD4+ T淋巴细胞的信号调控机制

Epidemiological studies have shown that nickel as the most common contact allergen in industrialized countries s can induce allergic dermatitis, which Belong to Ⅳ type hypersensitivity. More and more scientists have pay attention to explore the cause and the regulating mechanism. Studies have found that the activation of CD4+ T lymphocytes play an important role in Ⅳ type of hypersensitivity. Our previous study found nickel chloride can direct activation of CD4+ T lymphocytes, thereby promoting for such allergic reaction, but the specific mechanism needs to be further elucidated. So this research plans to take advantage of the newly developed quantitative proteomic technology - iTRAQ, for studing molecular mechanism of nickel activation of CD4+ T lymphocytes. Specific strategies include screening with iTRAQ technology to make clear expressing quantity change and modification after translation of protein, which before and after exposure to nickel in CD4+ T cells. We will validate the differences protein by Western blot method in cell lines and primary cell. Moreover interference or overexpression of candidate genes will help us to find how these genes play in the process of specific functions in the nickel activation of CD4+ T lymphocytes. All of these researches not only can further clarify the molecular mechanism of nickel activation of CD4+ T lymphocytes and also reveals the mechanism of the Ⅳ type hypersensitivity and possible treatment.

流行病学研究表明，镍作为工业化国家中最普遍接触的过敏原能够诱发变应性皮炎。变应性皮炎属于Ⅳ型超敏反应，对其诱发以及调节机制的探索受到越来越多的重视。研究发现，CD4+ T淋巴细胞的活化在此型超敏反应中发挥重要作用。本室前期发现氯化镍可以直接活化CD4+ T淋巴细胞，进而促进为此类超敏反应的发生，但其具体机制还需要进一步阐明。因此本课题拟利用新近发展的定量蛋白质组学技术-iTRAQ技术，研究镍活化CD4+ T淋巴细胞的分子机制。具体策略包括通过iTRAQ技术筛选CD4+ T淋巴细胞中镍暴露前后表达量以及翻译后修饰发生变化的蛋白质；通过Western blot等方法在细胞系以及原代细胞中验证差异蛋白质；干涉或过表达候选基因找到其在镍活化CD4+ T淋巴细胞过程中发挥的具体功能。以上研究不仅可以进一步阐明镍活化CD4+ T淋巴细胞的分子机制，还可以揭示Ⅳ型超敏反应的发生机制以及可能治疗途径。

镍作为工业化国家中最普遍接触的过敏原能够诱发变应性皮炎。变应性皮炎属于Ⅳ型超敏反应，是由T淋巴细胞介导的免疫损伤。致敏的T淋巴细胞是Ⅳ型超敏反应发生的关键。而T淋巴细胞的致敏，依赖于T淋巴细胞的有效激活。明确镍如何激活T淋巴细胞，对于控制镍诱发变应性皮炎有重要意义。.本研究建立了镍活化T淋巴细胞的模型。我们的实验体系中，镍不仅能够在mRNA水平和蛋白水平上调IL-2的表达，而且还能够促进CD69的表达。我们进而采用磷酸化肽段富集结合iTRAQ技术研究镍处理前后细胞内发生的生物学变化。利用SDS-PAGE分离样品，并用考染染色，确定组间样品总量的一致性。将酶切后的肽段进行定量以及质谱鉴定。共鉴定磷酸化肽段5592个，分别属于2149个蛋白质。.采用经典的佛波酯（PMA）和离子霉素（ionomycin）处理作为阳性对照。PI处理组能够检测到蛋白激酶C（Ser226）磷酸化水平明显增高。这个磷酸化的位点以及变化趋势都曾在多篇文献中被报道。我们的实验体系中得到印证，可以侧面证明我们的实验体系是可靠的。同时，不同于PI刺激，镍处理并不能激活蛋白激酶C（PKC）（Ser211）磷酸化。说明镍激活是不通过PKC的。作为阳性对照，还有络氨酸激酶（Lck）（Tyr35/ Ser121），这两个位点可以被PI刺激激活，却不能在镍处理组激活。有些蛋白质是PI和镍均能激活磷酸化的。上皮细胞转化蛋白2 （Ser880/Tyr881）在PI刺激后增高4.5倍，镍也能使其磷酸化水平增加2倍。膜相关孕激素受体组分2（Ser104）在PI处理组有2倍的增加，但是镍处理后却有近4倍的增加。说明PI和镍处理能激活共同的信号通路引起T细胞的活化。与PI对T细胞进行刺激相比，酪氨酸蛋白磷酸化受体6（Ser211/ 321/322）在PI的刺激下没有出现磷酸化，而镍刺激会导致这几个位点的磷酸化。说明镍处理有其特异性激活的信号通路。我们将差异蛋白进行通路分析， PI刺激与镍刺激进行对比，发现PI刺激后，蛋白质苏木化、细胞与细胞相互连接、DNA解旋在镍刺激体系中也有出现，但镍刺激体系中还出现了DNA修复和组蛋白3甲基化的上调。而在磷酸化下调的蛋白中，两个刺激体系基本没有相同的蛋白。值得注意的是，在磷酸化上调蛋白的细胞定位中，PI处理组主要集中在膜定位。而镍处理因为其离子特性，磷酸化上调蛋白主要集中在胞核中。