云南部分大叶种茶内生放线菌多样性及生物学活性研究

植物内生菌是一类具有广阔开发前景的微生物资源。大叶种茶是云南特有的茶树资源，也是生产普洱茶的重要原料。但对云南大叶种茶内生放线菌的分布规律、多样性特征等尚未进行过全面系统的研究。本项目将在云南不同地区采集10余种具不同特性的大叶种茶栽培品种，在已有工作基础上通过结合植物内含成分分析，比较不同的样品预处理方法，设计适合的选择性分离培养基等，研究适合于云南大叶种茶树内生放线菌的分离技术，并采用多相分类技术对分离到的内生放线菌菌株进行系统鉴定；同时结合免培养法研究茶树内生放线菌的多样性特征和种群分布规律。对分离得到的菌株采用多种方法进行抗菌活性筛选，以得到对茶饼病、茶轮斑病等常见茶树病害病原菌具明显拮抗作用，有开发潜力的内生放线菌菌株。本项目的实施将为可培养植物内生放线菌的分离技术改进、内生菌资源的开发利用提供重要的理论和实验依据，并可为茶树病害的有效生物防治和生物农药的开发提供新的微生物资源。

本研究以云南特有的大叶种茶树材料，采用高通量测序构建基因克隆文库的免培养方法，结合纯培养分离方法研究了不同品种大叶种茶树根、茎、叶内生放线菌的多样性，通过多相分类研究获得了该植物内生放线菌的新菌种资源， 并对分离菌株进行抗菌活性筛选，农业病害的防治和开发新型农用抗生素提供放线菌资源和理论依据。.通过高通量测序成功构建了3个大叶种茶无性系品种和1个有性系群体种以及一个野生的大理茶品种根、茎、叶内生放线菌16S rRNA基因克隆文库，检测到一些未培养的茶树内生放线菌，同时发现，不同茶树品种内生放线菌多样性差别很大，同一品种的根、茎、叶内生放线菌组成也差别较大。免培养和纯培养方法都证实，大叶种茶树中产丝放线菌的类群较为单一，主要分布的是链霉菌属的菌株。.通过研究大叶种茶树内生放线菌的分离方法，发现使用PVP沉淀茶多酚可有效提高茶树内生菌的出菌率。用10%NaHCO3浸泡茶树组织块，可有效抑制内生真菌的生长，提高内生放线菌的出菌率。从大叶种茶树根、茎、叶中分离获得内生放线菌524株放线菌。对菌株测序表明分离到的产丝放线菌主要为链霉菌（Streptomyces），还有少量假诺卡氏菌属（Pseudonocardia），诺卡氏菌属（Nocardia），拟无枝酸菌属的菌株（Amycolatopsis）。分离放线细菌包含1个纤维单孢菌属Cellulomonas和一个Patulibacter属的潜在新种。.对纤维单孢菌属的潜在新种进行了包括形态特征，生理生化测定、细胞化学组分分析和16S rRNA基因序列系统发育分析的多相分类研究，确定其分类地位，菌株CXTC45是纤维单孢菌属的一个新种。.结合PKS、NRPS 基因筛选结果，对阳性菌株进行了抗菌活性筛选，结果发现61株内生放线菌对检测的一种或多种指示病原真菌表现出抑制活性。.结合免培养与纯培养方法证实，内生放线菌在大叶种茶树的根、茎、叶的分布类群差别很大，具有器官特异性，而不同茶树品种的同一器官可具有一些相似的内生放线菌类群。