嗜热厌氧乙醇杆菌中还原力感应蛋白介导乙醇代谢调控的分子机理

高温菌乙醇发酵是纤维素乙醇生产的有效途径，因此嗜热厌氧乙醇杆菌成为研究热点。最近的研究发现，嗜热厌氧乙醇杆菌的乙醇代谢关键酶的基因表达受还原力感应蛋白（Tet-RSP）的调控。本项目将研究Tet-RSP与DNA的相互作用，分析结合位点的碱基序列和DNA结构特征；研究以辅酶NAD(P)+和NAD(P)H构成的还原力或微环境的氧化还原状态对Tet-RSP与各结合位点的结合力的影响；利用嗜热厌氧乙醇杆菌的RNA聚合酶的核心酶和Sigma因子建立体外转录检测系统，用以模拟相关基因的转录水平和转录调控机制；通过体外转录检测Tet-RSP对adhE 和adhB的转录调控作用，分析还原力水平与乙醇代谢关键酶基因转录水平之间的关系，阐明还原力对高温菌乙醇代谢的调控作用及分子机制，为提高乙醇产量的代谢途径工程获得理论依据。本项目是在乙醇代谢研究的最新进展的基础上开展工作，具有研究特色和创新性。

嗜热厌氧杆菌具有代谢速度快、水解纤维素能力强、戊糖转化率高等特点。但是目前嗜热厌氧杆菌发酵生产乙醇的浓度还很低，要提高嗜热厌氧杆菌乙醇的产量，首先要解析其乙醇代谢网络，找到其中与乙醇代谢密切相关的酶，及其调控蛋白，才能对其进行代谢工程，从而提高乙醇产量。因此本课题要实现的主要目标是：阐明还原力感应蛋白RSP介导嗜热厌氧杆菌糖酵解和乙醇代谢的分子机制，为嗜热厌氧杆菌的代谢工程提供靶点。.（1）在嗜热厌氧杆菌中发现了能对乙醇代谢关键酶基因进行调控的蛋白PadhE-1和PadhE-2 (RSP)。通过比对发现调控蛋白PadhE-1与全局调控因子CcpA具有同源性，而RSP具有NAD(P)-binding结构域，与还原力感应蛋白具有同源性。.（2）通过凝胶阻滞实验，发现1 mmol/L的NADH能完全抑制RSP与醇脱氢酶基因adhB的启动子区域 (TRRadhB) 和醛/醇脱氢酶基因adhE的启动子区域 (TRRadhE) 的结合，而1 mmol/L的NAD+，NADP+，NADPH对RSP的DNA结合活性没有明显的影响；圆二色谱的检测结果表明，NADH能使RSP的-螺旋减少和β-折叠片增加。.（3）成功构建了嗜热厌氧杆菌体外转录系统，通过体外转录实验证实RSP能抑制基因adhB的转录，而NADH能解除RSP对adhB转录的抑制，NAD+虽然不能解除RSP对adhB转录的抑制，但NAD+能干扰NADH的作用。还原力感应蛋白RSP是迄今首次发现的糖酵解途径与发酵途径之间的调控枢纽。.（4）确定了RSP与adhB和adhE上游启动子区域的结合位点，得到了完全互补的回文序列-ATTGTTANNNNNNTAACAAT-；对回文序列进行了定点突变，分析了其碱基偏好性。研究发现序列与回文结构越接近，其与RSP的结合力越强。这些结果说明，嗜热厌氧杆菌能通过操纵序列碱基差异而对乙醇代谢进行精密调控。.（5）通过对嗜热厌氧杆菌进行代谢工程，发现导入adhE基因能增加乙醇产量。对adhE启动子的重新设计，解除RSP对adhE基因的转录抑制并不能进一步提高乙醇的产量。分析其中的原因，发现当环境中的乙醇达到一定浓度的时候 (乙醇浓度1 %)，AdhB的催化特性发生逆转主要表现为催化逆反应，即消耗乙醇。因此进一步提高乙醇产量需要对AdhB进行定向进化，消除逆反应。