西藏地区传统发酵乳制品中乳酸菌多样性研究

西藏地区地理复杂，生态环境多样，是生物物种资源较为丰富的地区。本研究以西藏高原藏南、藏东北、藏东南、藏西南、藏西和藏北6个生态区传统发酵乳制品（酸奶、奶渣和奶酪）为研究材料，用传统微生物方法研究形态、理化特征和数值分类的基础上，采用随机扩增多态性（RAPD）技术、PCR-DGGE以及16S rRNA序列测定相结合，分析这一特殊资源中乳酸菌的种群多样性、表型多样性和菌种资源的遗传亲缘关系，探明西藏六个生态环境地区和不同畜种的传统发酵乳制品中乳酸菌的种类、生物学特性、优势种以及乳酸菌种群结构；探索乳制品中新菌种资源和积累菌种资源建立西藏地区乳酸菌的资源库，探索比传统菌种鉴定方法更准确、快速简便的分子生物学鉴定方法，保护西藏乳制品菌种资源的专利权，为传统乳制品的产业发展提供基础数据。

本研究从西藏地区7地市37县的100多个牧民家庭采集传统发酵乳制品共119份，分析西藏传统发酵乳制品营养和卫生状况，釆用三种方法（纯培养、DGGE和随机扩增多态性）分析了我国西藏地区传统发酵制品中的乳酸菌的多样性。结论如下： .1.采用稀释倾注平板计数法检测酸奶、曲拉乳酸菌活菌数平均含量为6.38±1.54 log cfu/mL、2.26±2.95 log cfu/g。分离获得乳酸杆菌117株，乳酸球菌49株。2.通过传统与分子鉴定表明：226株乳酸菌分属于乳杆菌属(Lactobacillus)等6属16个种，乳杆菌属占分离株的78.32%为优势菌群，L .casei占分离株的34.96%为优势菌种，以L.casei＞L.plantarum＞L.buchner＞L. fermentum。酸奶、曲拉的优势菌分别是：杆菌L .casei（44.17%）和球菌Ln. mesenteroides（8.33%)、杆菌L .casei（24.53%）和乳球菌属、片球菌属（12.26%)。3.建立了西藏地区传统发酵乳制品中乳酸菌的16SrDNA基因序列数据库,菌株登录号为： KF673493至KF673549。4.PCR-DGGE分析结果显示：19份乳制品中包含乳酸杆菌属等5个属12个种；以乳酸杆菌略多于乳酸球菌，最多的菌种是L. delbrueckii，其次为S. thermophiles、L. lactis，L. delbrueckii在7个牧区普遍存在，为优势菌种。样品图谱的聚类与地域之间无明显的相关性，与发酵乳制品种类有一定的相关性。5.纯培养与PCR-DGGE方法均证实西藏传统发酵乳制品中乳酸菌种类丰富多样，乳杆菌为优势菌群，L .casei和L.delbrueckii为优势种。二种方法各具优势，纯培养法只能分析到可培养菌，优点是获得分离株可以用于资源利用；PCR-DGGE 能快速地反映出样品中菌群结构；二方法其优势菌差异反映出L.casei与 L.delbrueckii适应耐受能力不同。6.应用 RAPD技术分析与16S rRNA序列分析结果相对比，两种基因型方法得出结果基本是一致的，西藏与云南的菌株较多地聚在同一组，与新疆菌株很少聚为一组。.本研究系统地分析了西藏地区发酵乳制品中乳酸菌的多样性，探索分子生物学鉴定方法，为传统乳制品的产业发展提供基础数据。