基于乳腺上皮细胞FcRn胞吞转运途径的金黄色葡萄球菌多价毒力因子疫苗设计及其诱导免疫应答效果的研究

Staphylococcus arues is the most significant pathogens.Domestic and foreigen researches indicated the effect of vaccine for S.aureus caused bovine mastitis is unsatisifactory.According to recently researches,there are a lot of FcRn in the mucous epithelium which could specially bind to Fc fragment when it link the antigen.FcRn could mediate transcytosis to transport antigen across mucous to act antigen submission fuction to induce special immunity of mammary gland.There are numerous FcRn in teat duct mucous epithelium and gland cistern mucous epithelium.Consequenty,we will use the vaccine based on capsular polysaccharide and adhesins polybalent virulence factors which bind to IgG Fc fragment and produce antigen-antibody complex vaccine by mammary gland immunity,teat duct injection immunity and intramuscular injection immunity to do the rat immunization and dicuss the effects of the vaccine by different vaccine compositions and different immunization methods,which establishes the effective vaccine of bovine mastitis of S.aureus induced Mastitis in dairy cows.

S.aureus是最重要的奶牛乳腺炎致病菌，国内外针对S.aureus疫苗的研究做了大量探索，但均未取得满意效果，究其原因，主要是这些疫苗没能诱导机体产生良好的免疫应答特别是乳腺免疫应答。近年来研究发现，黏膜上皮细胞含有大量FcRn，而且当其与抗原结合的IgG Fc片段特异性结合后，可介导胞吞转运作用转运抗原穿过黏膜屏障，刺激免疫细胞产生免疫应答。乳头管和乳池粘膜也有大量FcRn,根据这些研究结果，本研究拟将以S.aureus的荚膜多糖和黏附素结合蛋白为基础构建的多价毒力因子疫苗中构入IgG Fc片段，并利用制备的抗体构建抗原抗体复合物疫苗，通过乳头管、乳腺基底部以及肌肉注射等不同途径对试验大鼠进行免疫，比较构建的不同组成的疫苗和不同免疫途径对大鼠乳腺免疫应答的影响，从而确定乳腺中的FcRn是否可转运抗原及这种转运是否依赖IgG完整性，为研制有效的奶牛S.aureus性乳房炎疫苗打下基础。

金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的重要病原菌之一，目前尚未研制出有效防控该菌的乳房炎疫苗。因此，我们基于乳腺上皮细胞FcRn胞吞转运途径研制金黄色葡萄球菌多价毒力因子疫苗，并对其诱导免疫应答的效果进行了研究。.大鼠免疫实验：大鼠IgG的Fc段与FnBPB-ClfA融合为rFc-FnBPB-ClfA，经原核表达、并制备其偶联物CP8+rFc-FnBPB-ClfA后，将蛋白配合铝盐佐剂或大肠杆菌不耐热肠毒素B佐剂，以肌肉注射途径首次免疫、乳头管注射途径加强免疫的方式免疫哺乳期的Wistar大鼠。加强免疫7 d后，大鼠血清和乳清抗体效价最高分别达到1:102400、1:1600，IgG亚型以IgG1为主，IL-4和IFN-γ的含量均显著提高，大鼠脾淋巴细胞刺激指数、全血杀菌能力均显著高于对照组（P＜0.001），且免疫组攻毒后大鼠乳腺金黄色葡萄球菌的分离率显著低于对照组（P＜0.001）。.本动物实验：奶牛IgG的Fc段与FnBPB-ClfA融合为bFc-FnBPB-ClfA，经原核表达后，将蛋白配合铝盐佐剂或1%盐酸左旋咪唑佐剂，以首次免疫经肌肉注射、加强免疫经乳头管灌注的免疫途径对患有隐性乳房炎且临近干奶期的奶牛进行免疫。以左旋咪唑为佐剂免疫的奶牛血清、乳清抗体效价最高，分别达到1:1600、1:400；免疫奶牛的奶样中体细胞数低于10万每毫升，免疫效果良好。.体外细胞实验：原代奶牛乳腺上皮细胞（pbMECs）体外胞吞转运实验设置温度处理组（37℃、4℃）、蛋白A处理组、胞转途径抑制剂处理组，结果证明FnBPB-ClfA和bFc-bFc-FnBPB-ClfA均可被转运跨过pbMECs屏障，该转运作用呈温度依赖性，并非细胞旁路扩散作用。蛋白A对FnBPB-ClfA的跨细胞转运及亚细胞定位无明显影响，但明显减少了bFc-FnBPB-ClfA的跨细胞转运及其在细胞膜蛋白、骨架蛋白中的数量，证明了pbMECs的FcRn与抗原结合的IgG Fc片段的结合可介导胞吞转运作用转运bFc-FnBPB-ClfA穿过黏膜屏障，促进抗原递呈作用，刺激哺乳动物乳腺产生良好的局部及全身的特异性免疫应答。.综上所述，Fc融合蛋白Fc-FnBPB-ClfA辅以优化的免疫方式（免疫途径为肌肉注射首次免疫、14天后乳头管注射灌注加强免疫），对于防控金黄色葡萄球菌引发的奶牛乳房炎具有较大潜力，值得推广。