奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌的黏附及其免疫应答分子机制研究

Staphylococcus aureus is the major pathogenic factor induced mastitis in cows. The previous studies were conducted more concentrated in the areas of prevention and treatment of mastitis. But the mechanisms of infection and pathogenesis, immune and defense are discussed in very little. Therefore, this research will conduct closely around the molecular mechanism of Staphylococcus aureus adhesion characteristics and immune response. The ability of S. aureus invasion mediated by different adhesins and environmental factors was carried out through establishment of in vitro model of Staphylococcus aureus invasion of cells. At the same time, interaction between Staphylococcus aureus and cells was explored using two-dimensional electrophoresis (2-DE), mass spectrometry (MS), real-time fluorescence quantitative laser of aggregation, flow cytometry, gel retardation electrophoresis and other means and methods. And the changes of proteomic, Toll-like receptor, inflammatory factors were also analyzed. Through this study, it hopes to reveal the molecular mechanism of infection, pathogenic and immune response of Staphylococcus aureus. Then it will lay theoretical foundation for development of the diagnosis, prevention and new therapeutic agents for Staphylococcus aureus, and provide new clues for infection, prevention and control of other pathogens.

金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要病原性因素，前期研究多集中于预防与治疗领域，而对其感染与致病机制、免疫和防御机理等方面涉足甚少。鉴于此，本研究将紧紧围绕金葡菌的黏附特性及免疫应答分子机制展开相关研究。通过建立金葡菌侵袭细胞的体外实验模型，研究不同黏附素及环境因素对金葡菌侵袭能力的影响；同时，利用二维电泳（2-DE）、质谱（MS）、实时荧光定量、激光共聚集、流式细胞术、凝胶阻滞电泳等手段和方法，开展金葡菌与细胞相互作用的蛋白质组学分析以及Toll样受体、炎症因子等的变化，以期揭示金葡菌的感染、致病与免疫应答分子机制，从而为金葡菌的诊断、预防及新型治疗药物的研制奠定理论基础，提供重要思路，同时也为其他病原菌的感染与防治提供新的线索。

金黄色葡萄球菌作为引起奶牛乳腺炎的主要病原性因素，目前已围绕其开展了诊断以及疫苗研究，特别是针对其主要黏附因子、也是重要免疫原性因子凝集因子与纤黏连结合蛋白进行了大量研究，但关于其感染致病以及免疫分子机制方面的研究鲜有报道。因此，本研究立足于前期工作基础，开展了金葡菌与细胞相互作用的前沿探索研究，取得的主要成果为：.（1）完成了金葡菌主要黏附因子的克隆与表达。通过分析金黄色葡萄球菌主要黏附蛋白凝集因子A和纤黏连结合蛋白，设计引物，对上述两个基因的活性区域进行了克隆，并在真核细胞中成功表达，为下一步机制研究奠定了坚实基础。.（2）建立了奶牛乳腺上皮细胞培养技术平台。总结并借鉴国内在鼠、山羊、水牛等乳腺上皮细胞培养的经验及技术方法，以健康奶牛乳腺组织作为实验材料，进行了奶牛乳腺上皮细胞的培养和综合评价鉴定，建立了奶牛乳腺上皮细胞培养技术体系。.（3）建立了细菌表面蛋白的分离与鉴定技术平台。利用乳酸菌作为初始对象，建立了细菌表面蛋白分离与质谱鉴定、肽库搜索平台，为金葡菌研究提供了模板。.（4）完成了金葡菌主要黏附因子的生物信息学分析。利用 String 9.0 与KEGG分析软件，对金葡菌主要黏附因子凝集因子A（ClfA）、纤黏连结合蛋白（Fnb）的相互作用蛋白及其参与通路进行了预测与分析，为下一步研究指明了方向。.（5）建立了Toll样受体等细胞因子荧光定量检测技术。通过筛选，合成了包括TLR2、TLR4､TLR9在内的15对实时荧光定量PCR引物，并建立了相应的检测技术平台，为检测金葡菌感染细胞后各因子变化奠定了技术平台。