慢乙肝患者肝组织内HBV核酸、抗原分布异质性与疾病自然史、预后的关系及其机制研究

“Heterogeneity” is one of the inherent features of all multi-cellular organisms, which also holds true for the human liver. In order to examine the intrahepatic distribution of HBV nucleic acids, we developed an in situ hybridization (ISH) assay which was capable of visualizing HBV pregenomic RNA (pgRNA), relaxed circular DNA (rcDNA) and covalently closed circular DNA (cccDNA) at single-cell level. Unexpectedly, combination of HBV DNA ISH and viral antigen immunohistochemistry revealed a “mosaic” distribution. It was found that three stages, i.e., antigen-rich stage, DNA-rich stage and latent stage, co-existed inside the human liver. Based on these observations, the current project plans : 1. To Improve and establish a quantitative work-flow for in situ detection of HBV nucleic acids and antigens. Based on this methodology, a comprehensive survey on distrubution of each stages during the natural course of chronic hepatitis B infction will be donducted. 2. To evaluate the longitudinal changes in the positive rate of HBV nucleic aicds and antigens before and after antiviral therapy. 3. To enrich hepatocytes in different stages using laser capture and microdissection and to obtain global expression profile using next-generation RNA sequencing. The differential signaling network deduced from expression profiles will be further confirmed using in situ RNA and protein analysis. Collectively, the data generated in this project would be instrumental for a deeper understanding of the complex intrahepatic life style of HBV and for identification of novel molecular targets aiming to eliminate cccDNA and hence a final cure of HBV infection.

"异质性"是高等生物的最根本特性之一,此特性在人类肝脏中也有充分体现。为探讨乙肝病毒核酸在感染患者肝脏中的分布特点，本研究组成功建立一种能够在单细胞水平显示病毒pgRNA,rcDNA和cccDNA的原位杂交方法。将该方法与病毒抗原免疫组化结合后，意外发现抗原与核酸呈现“马赛克状”分布。在单细胞水平存在抗原富集期,DNA富集期和潜伏期三个阶段。基于上述发现,本项目拟：进一步建立完善HBV核酸原位杂交与抗原免疫组化定量分析方案，进而探讨处于自然史各时期患者肝组织内核酸与抗原在单细胞水平的分布差异; 分析在抗病毒治疗前后肝组织中病毒核酸与抗原的变化趋势;利用激光显微切割技术分离不同阶段的肝细胞，二代测序获得表达谱，分析不同阶段肝细胞的信号通路差异，并进一步在组织水平进行验证。本研究将深化对HBV肝内生活周期复杂变化模式的理解，为最终清除cccDNA，治愈乙肝提供理论基础与分子靶标。

慢性乙型肝炎是我国发病率高，严重影响国民健康的一种传染性疾病。慢乙肝的治疗目前虽已有有效的方案，但病毒清除率仍然较低。为探讨乙肝病毒核酸在感染患者肝脏中的分布特点，本研究组前期成功建立一种高灵敏度HBV核酸原位杂交方法。将该方法与病毒抗原免疫组化结合后，意外发现抗原与核酸呈现“马赛克状”分布。在单细胞水平存在抗原富集期,DNA富集期和潜伏期三个阶段。本课题进一步建立完善了HBV核酸原位杂交与抗原免疫组化定量分析方案，在临床大样本队列中比较原位杂交检测与多种常见（血清HBV DNA，组织免疫组化）与新型标志物(HBcrAg, 血清HBcAb)的表现，确认了HBV DNA原位杂交在慢乙肝患者中高阳性率（95.2%）与特异性，并发现肝内HBV DNA与血清HBV DNA, HBcrAg等均有高度相关性。此外，我们还开发了HBV DNA, HBsAg,天狼星红三重染色技术，实现在一张切片中同时获得病毒DNA, S抗原以及胶原纤维的空间分布情况。研究初步发现S抗原富集的细胞通常位于纤维化较低的区域， DNA富集细胞通常与胶原纤维侵入肝实质相关。 进一步对肝活检表达谱的分层分析与原位杂交-免疫组化共染色分析揭示了S抗原富集期细胞表现为核糖体蛋白与线粒体氧化磷酸化基因的上调表达，细胞表现为蛋白质合成水平高，能量代谢旺盛。而DNA富集期细胞表现为肝细胞特异性标志物（Hepar-1）与转录因子（HNF4A）的下调表达，肝细胞特性下降，胶原纤维在肝实质中的侵入与抗原富集期到DNA富集期的转换具有显著关联。 基于上述观察，我们在原有的“三阶段”模型的基础上加入肝纤维化因素，提出了更新的三阶段理论。本研究的结果为病理学评估慢乙肝的疾病发展提供了丰富的病毒、组织学空间信息。我们将本研究获得的大量图像信息整理上传到专门的网站（www.hepb-atlas.org），供同行参考。本研究的相关成果为揭示乙肝病毒持续感染造成的致病机制提供了独特的视角，也为新型抗病毒疗法的开发提供了线索。