大肠杆菌合成黄酮类化合物关键前体丙二酰辅酶A的代谢调控

Flavonoids are a group of important plant natural products that have diverse biological activities. Flavonoids have promising applications in food, health products and pharmaceutical industries. Though researchers achieved the production of different flavonoids in microorganisms, the yield is still very low. Previous researches showed that the bottleneck in improving the yield of flavonoids was caused by the limited understanding on the metabolism of the malonyl-CoA, which is one of the most important precursors of flavonoids. Besides, effect of the malonyl-CoA on the cell growth and main metabolic pathway in Escherichia coli still remains largely unknown. In this project, the malonyl-CoA metabolism was regulated by modular and anti-sense RNA based strategies. By using the strategies, a series of E. coli strains with different ability in malonyl-CoA biosynthesis were obtained. Therefore, effect of the malonyl-CoA on the cell growth and main metabolic pathway could be investigated with these strains. Besides, based on the understanding of the malonyl-CoA metabolism, the metabolic networks of several typical flavonoids would also be optimized to achieve the high efficient production of these chemicals in E. coli.

黄酮类化合物是一类重要的植物天然产物，具有多种多样的生物活性，在食品、保健品和医药工业等领域具有广泛的应用前景。尽管研究人员已经在微生物中实现了一些黄酮类化合物的异源合成，但是产量仍然较低。导致微生物异源合成黄酮类化合物效率较低的关键问题，在于目前对于黄酮类化合物关键前体物质丙二酰辅酶A的代谢调控及其对大肠杆菌的细胞生长与关键代谢途径的作用缺乏了解。因此，本项目拟通过基于多位点的反义RNA调控和代谢途径模块化调控策略，实现大肠杆菌中丙二酰辅酶A代谢途径的理解调控。利用具有不同丙二酰辅酶A合成与供给能力的一系列大肠杆菌工程菌株，系统考察丙二酰辅酶A代谢对细胞生长与关键代谢途径的重要影响。在此基础上，通过系统调控大肠杆菌的丙二酰辅酶A代谢过程，优化典型黄酮类化合物的代谢途径，揭示丙二酰辅酶A代谢对黄酮类化合物合成过程的的定量关联。

黄酮类化合物是一类重要的植物天然产物，具有多种多样的生物活性，在食品、保健品和医药工业等领域具有广泛的应用前景。尽管研究人员已经在微生物中实现了一些黄酮类化合物的异源合成，但是产量仍然较低。导致微生物异源合成黄酮类化合物效率较低的关键问题，在于目前对于黄酮类化合物关键前体物质丙二酰辅酶A的代谢调控及其对大肠杆菌的细胞生长与关键代谢途径的作用缺乏了解。在本项目中，我们首先证明了定位在目标基因5’-UTR(untranslated region)不同位置的asRNA (antisense RNA)具有不同强度的基因沉默效果。据此设计了不同沉默强度的asRNA来平衡胞内丙二酰辅酶A浓度、细胞生长和柚皮素的产量三者之间的关系。最后确定适当沉默fabB和fabF使柚皮素的产量增加了431%达到391 mg/L。构建了一个CRISPRi (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats interference)系统用于微调大肠杆菌的中心代谢途径提高丙二酰辅酶A的代谢通量。通过设计的sgRNA定向沉默目标基因并结合基因修饰改善细胞的生长，使得胞内乙酰辅酶A浓度提高了233%，最终目标产物柚皮素的产量较出发菌株增加了7.4倍达到421.6 mg/L。根据转录组数据获得了104个梯度强度的大肠杆菌组成型启动子序列PUTR(promoter-5'-UTR complexes)，相较于pBAD启动子，这些启动子的转录强度横跨0.007% - 4630%，表达强度横跨0.1%-137%。梯度启动子可以即插即用，方便快捷的调整复杂黄酮类化合物代谢途径中基因的表达强度。使用不同强度的启动子随机组装柚皮素合成基因，最终确认CHS与CHI高表达有助于柚皮素的合成，进一步确定了胞内丙二酰辅酶A浓度低是黄酮类化合物合成的限速步骤。相关工作为代谢工程改造微生物异源合成黄酮和其他以辅酶A作为前体的重要化合物，提供了必要的理论和技术支撑。