构建四膜虫毒力评估模型高通量筛选嗜水气单胞菌毒力相关基因

合适的宿主对高通量筛选细菌毒力基因至关重要。本项目拟以人-兽-鱼共患病病原菌嗜水气单胞菌为研究对象，在已有的嗜水气单胞菌与四膜虫互作关系研究的基础上，构建四膜虫毒力评估模型，以四膜虫为宿主模型评估嗜水气单胞菌不同毒力基因型菌株的毒力，同时进行鱼体感染试验，分析两种宿主研究菌株毒力的相关性；评估对鱼体致病重要的嗜水气单胞菌毒力因子（胞外毒力因子及QS调控系统）对四膜虫群体生长的抑制作用，确定以四膜虫筛选细菌毒力因子的可行性；进一步利用四膜虫宿主模型评估嗜水气单胞菌信号标签诱变突变株的毒力，筛选出嗜水气单胞菌新的毒力相关基因。研究结果具有重要的科学意义和很好的应用前景，不仅丰富了对嗜水气单胞菌致病机制的认识，同时为毒力菌株的高通量筛选探索一条新途径。

嗜水气单胞菌是一种人-兽-鱼共患的病原菌，建立合适的宿主模型对高通量筛选及鉴定菌株毒力至关重要。本项目探讨以四膜虫作为模型评估气单胞菌毒力的可行性。首先，以斑马鱼作为模型，测定了39株气单胞菌的半数致死量（LD50），结果显示LD50的变化范围介于1.3×102 ~ 3.0×107，表明这些菌株的毒力范围较广，适宜作为四膜虫的毒力评估对象。在此基础上，将四膜虫与气单胞菌共培养，测得菌株的相对存活率与该菌株LD50呈负相关，而四膜虫的相对存活率与该菌株LD50呈正相关。经分析确定：如以细菌的相对存活率为判定依据，则相对存活率高于60%时，可判定该菌株为有毒株；低于40%时，判为无毒株。如以四膜虫的相对存活率为判定依据，当四膜虫相对存活率低于40%时，判定该菌株为有毒株，而高于50%时，判为无毒株。为将四膜虫模型用于高通量筛选嗜水气单胞菌毒力基因，利用转座子插入突变技术构建了1030株嗜水气单胞菌插入突变株，并利用已构建的四膜虫毒力评估模型筛选出94株毒力减弱的突变株，随后以斑马鱼为模型测定了其中36株插入突变株的LD50，结果显示，36株插入突变株中有33株毒力明显下降，进一步说明四膜虫毒力评估模型与斑马鱼模型有较好的符合率（91.7%，33/36)。随后，采用热不对称交叉PCR技术结合测序分析，最终确定了21个失活靶基因。为了对筛选得到的失活靶基因进行分析，同时也为了比较不同年代分离的嗜水气单胞菌在基因水平上的差异，将实验室于1989年分离得到的嗜水气单胞菌J-1株以及在2010年分离得到的嗜水气单胞菌NJ-35株进行了全基因组测序，显示2株菌基因组结构存在一定的差异，特别是NJ-35株基因组中存在2个J-1株没有的可能毒力岛。在全基因组注释的基础上，分析21个基因插入位点，发现有15个插入到编码区，其中1个基因已报道为嗜水气单胞菌毒力相关基因，另有2个基因在其他细菌中也已证实为毒力相关基因。该结果在一定程度上证实了利用虫-菌互作模型高通量筛选毒力相关基因是一种有效且直接的途径；同时，候选毒力相关基因的确定，为后续进一步开展致病机制研究奠定了基础。总之，本项目发展了一种可替代动物进行感染试验并能快速评估病原菌毒力的模型，为高通量筛选细菌毒力因子探索一条新途径。项目执行期间，发表SCI论文6篇，中文核心期刊2篇；授权专利2项；获省优秀硕士论文1篇。