利用微流控芯片研究Myosin9b蛋白在胰腺癌神经侵袭中的分子机制

Neural invasion of pancreatic cancer cells is a critical route of cancer metastasis and represents a key feature of poor prognosis. Myosin9b (Myo9b), a member of class IX myosins, inhibits RhoA activity through its RhoGAP domain. Myo9b is identified as a downstream component of Slit/Robo signaling pathway, involving in tumorigenesis and tumor development. Our preliminary data demonstrate that Myo9b promotes neural invasion of pancreatic cancer cells. We have structurally characterized Myo9b RhoGAP and found that the Myo9b RhoGAP domain contains a unique patch that specifically recognizes RhoA. We identified that the sequence of 1361-1916 amino acids is required for Myo9b RhoGAP autoinhibition. Utilizing X-ray crystallography we are planning to solve the structure of Myo9b1361-1916 protein and its complex with RhoA, to analyze their internal structure and dysfunction of pancreatic cancer-related mutations. We use the molecular approaches to study the mechanisms underlying Myo9b RhoGAP autoinhibition. In addition, we propose to construct new microfluidic chip to elucidate the model, speed and direction of neural invasion of pancreatic cancer cells and screen the amino acids required for Myo9b-induced neural invasion of pancreatic cancer cells. Furthermore, we will study the role of Myo9b in pancreatic cancer metastasis with nude mice model. It will likely provide useful information for developing new diagnostic and therapeutic approaches for pancreatic cancer.

神经侵袭是胰腺癌转移的主要途径之一，也是预后较差胰腺癌患者的重要特征。Myosin9b（Myo9b）是Myosin家族成员，通过RhoGAP结构域抑制RhoA活性，亦可作为Slit/Robo信号通路下游分子参与肿瘤的发生发展。前期研究显示：Myo9b促进胰腺癌神经侵袭；RhoGAP通过Patch结构特异性识别RhoA；Myo9b的1361-1916氨基酸区域存在RhoGAP活性的自抑制。本项目运用X-射线晶体学解析Myo9b1361-1916蛋白及其与RhoA复合物的晶体结构，分析其内部结构及胰腺癌突变体对结构的影响；运用分子生物学方法验证Myo9b自抑制的调控机制；采用微流控芯片分析肿瘤细胞沿着神经侵袭的模式、速度及方向的改变，并筛选介导Myo9b促进胰腺癌神经侵袭的氨基酸；利用裸鼠致瘤模型探索Myo9b自抑制在胰腺癌转移中的功能意义。研究结果为开发有效的胰腺癌新型诊疗方法提供理论依据。

胰腺癌是侵袭性强、转移性高的恶性肿瘤。神经侵袭是肿瘤发生、发展和转移过程中的主要机制之一，也是肿瘤复发、转移和肿瘤患者预后差的一个重要指标。Myosin9b（Myo9b）是Myosin家族成员，作为Slit2/Robo1信号通路的下游分子，参与到肺癌转移过程中。但是在胰腺癌神经侵袭中的功能和分子机制尚未报道。因此，本研究项目从分子水平、细胞水平、动物模型和临床病例四个层面逐步深入分析Myo9b调控胰腺癌细胞神经侵袭及胰腺癌转移的分子机制。. 在本项目研究中，首先，我们与中国科学院生物物理研究所冯巍课题组合作，解析了Myo9b RhoGAP／RhoA复合物的晶体结构，分析了Myo9b RhoGAP和RhoA复合物的相互作用界面氨基酸的功能。其次，设计了针对肿瘤细胞神经侵袭的CaNeu微流控芯片，并研究了肿瘤细胞与神经轴突之间的相互作用。进而，利用CaNeu微流控芯片证明了Myo9b促进胰腺癌细胞的神经侵袭。然后，申请人构建了胰腺癌细胞坐骨神经侵袭的裸鼠模型。利用该模型证明Myo9b下调的胰腺癌细胞生长减慢，降低小鼠的下肢张力。进而发现Myo9b 下调的胰腺癌细胞对神经鞘膜损伤降低。最后，我们与第四军医大学西京消化病医院合作，收集了胰腺癌患者组织样本，制备成tissue-array芯片。分析了Myo9b在胰腺癌组织中的表达与胰腺癌神经侵袭的相关性。这为开发有效的胰腺癌神经侵袭新型诊疗方法提供理论依据。因此，靶向干预Myo9b蛋白有可能成为胰腺癌诊断与治疗的新靶点。