小菜蛾抗性相关基因CYP321E1蛋白表达及其参与氯虫苯甲酰胺抗性形成的分子机理研究

This project was focused on an important enzyme system, cytochrome P450 monooxygenases, which was involved in insecticide resistant. A novel P450 gene, CYP321E1 (GenBank No.: KC 626090) from diamondback moth (DBM), Plutella xylostella, has been isolated and characterized in our previous studies, and which would be further studied in this project based on the relevant knowledge and technical of molecular biology, biochemistry and insect toxicology. The recombinant protein CYP321E1 was exogenously expressed and the assay of enzyme activity was also conducted after the more pure expression protein was got by using the Ni-NTA affinity column chromatography. The effect of the recombinant protein CYP321E1 on the toxicity of chlorantraniliprole was detected by bioassay test. Then the degradation effect of the expression protein CYP321E1 to chlorantraniliprole was detected by GC/MS. Sequences alignment was used to find the mutation point which may result in resistant to chlorantraniliprole in different field strains. By real-time quantitative reverse transcription-PCR (RT-q PCR) technology, the transcript levels of CYP321E1 gene in different field strains were analyzed. All of the works have been done in present and previous studies to make a comprehensive understanding of the resistance mechanism of CYP321E1 to chlorantraniliprole in DBM at the molecular level, and will contribute to establish a rapid resistance diagnosis technique, even will influence the practice of chlorantraniliprole resistance management strategies for DBM.

本项目针对国内外P450基因介导昆虫抗性机理这一研究热点，以前期研究获得的一个小菜蛾P450新基因CYP321E1（GenBank No.: KC 626090）为研究对象，借助分子生物学、昆虫生理生化和毒理学研究等相关知识和科研手段，利用异源表达体系表达出CYP321E1蛋白并分析其酶学特性；通过生物测定法研究表达蛋白对氯虫苯甲酰胺毒性的影响；通过气相色谱法检测不同浓度表达蛋白对氯虫苯甲酰胺的体外代谢能力；通过不同品系CYP321E1基因序列比对分析与抗性相关的突变位点；应用荧光定量PCR技术分析不同品系CYP321E1基因表达量与抗性的关联性。最终，结合前期研究结果阐明CYP321E1基因介导小菜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性的分子机理。本项目的实施，可为下一步探索小菜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性快速诊断技术提供参考，为抗性治理提供理论依据。

小菜蛾是世界范围内十字花科蔬菜的重要害虫，具有产生抗性快、抗性强、抗性谱广等特点。双酰胺类新型杀虫剂氯虫苯甲酰胺，对抗性小菜蛾等鳞翅目害虫的防治效果突出。但田间不科学、不合理使用现象严重，小菜蛾对其很快产生了高水平抗性，且抗性机制研究不明确。本研究团队基于前期研究基础，应用分子生物学、毒力测定和转基因技术等方法，研究了抗性品系体内CYP321E1基因突变情况，基因表达量与抗药性相关性，以及表达蛋白对氯虫苯甲酰胺代谢等机理。研究结果已发表论文5篇，其中SCI论文2篇，中文核心期刊文章3篇，待发表SCI论文1篇。.通过3年研究，本项目基本完成原计划内容，并根据实际情况，调整了部分实验内容。（1）2014-2016年定点采集了多个对氯虫苯甲酰胺不同抗性的小菜蛾田间品系，并对CYP321E1基因ORF编码框氨基酸进行比对、分析，未检测到P450典型保守区域的氨基酸突变，多个点的抗性品系目标基因的ORF编码框氨基酸与敏感品系的基本一致；（2）明确了CYP321E1表达量上调，在小菜蛾对氯虫苯甲酰胺形成抗性中，具有重要作用，且表达量与抗性之间具有一定的正相关关系；（3）通过自诱导培养基，获得了CYP321E1的原核表达蛋白，表达蛋白纯化、复性后的酶活在pH9-11范围内相对最强，但进一步的体外代谢研究，复性后的目标蛋白对氯虫苯甲酰胺能力较弱；（4）顺利构建了昆虫细胞真核表达系统，获得能表达CYP321E1的sf9昆虫细胞，明确当321/CPR比例为10:1时表达的P450活性较高，且可通过体外代谢氯虫苯甲酰胺，一定程度降低小菜蛾在毒力测定中的死亡率；（5）构建转基因果蝇品系，并通过氯虫苯甲酰胺毒力测定，明确了携带目标基因的转基因品系，能显著降低对药剂的敏感性，从而降低死亡率。.通过上述研究，从CYP321E1基因ORF编码框突变分析、基因表达量与抗性关系分析、表达蛋白体外代谢分析和转基因果蝇毒力测定四个方面，系统验证了CYP321E1基因在小菜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性产生中的作用。研究结果为阐明小菜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性的分子机制，以及氯虫苯甲酰胺抗性的科学治理提供了重要的理论基础。