GABABR介导小分子G蛋白Rap1激活的分子机制研究

Rap1是小分子G蛋白Ras家族成员之一，在细胞增殖、分化、粘附和神经突触生长等方面起重要调节作用。代谢型γ-氨基丁酸跨膜受体（GABABR）是C族GPCRs的重要成员，通过与G蛋白偶联，介导神经系统中多种细胞应答和生理过程。我们在小鼠小脑颗粒神经元中发现GABABR激活后可诱导Rap1持续激活，并且发现Ca2+信号参与了此激活过程。本项目将在此基础上，利用Rap1GTP活性检测技术和膜片钳光电测量系统，结合逆转录病毒转染和RNAi干扰技术，对GABABR介导Rap1持续激活的分子机制进行深入而细致的研究，阐明GABABR/Rap1新信号通路，为以此通路为靶点的药物研发提供理论依据。并且拟利用活细胞高速激光共聚焦显微镜及全内反射多维图像工作站，探讨激活的GABABR对Rap1分子在细胞内定位的影响，为深入研究Rap1蛋白与GABABR跨膜蛋白间的相互作用机制及其生理意义打下基础。

GABAB受体属于G蛋白偶联受体C家族成员之一，是抑制性神经递质GABA的代谢性受体，介导缓慢而且持久的神经突触活动。Rap1是一种可以再活性与非活性间互相转换的小G蛋白分子，在细胞增殖、迁移、粘附、神经突触生长等生理功能中均发挥重要作用。在本研究中，我们首先利用表达GABAB受体C末端的融合蛋白GST-GB1-C或GST-GB2-C作为诱饵，在体外培养的小脑颗粒神经元细胞中，找寻结合到GABAB受体C末端的新的蛋白。通过银染，质谱分析，免疫印迹实验发现Ras家族成员的小G蛋白Rap1特异性的结合到GABAB受体GB1亚基的C末端，而且只有活性的Rap1GTP才能直接结合GB1亚基C末端，但不结合GB2亚基的C末端。同时我们证明了GABAB受体的激活会特异性的介导持续性的长时间的Rap1激活，受体激活Rap1是通过Gi/o信号的αlpha亚基通路传递的，而且Rap1GAPII参与这一过程。进一步我们证明了GABAB受体的激活会导致Rap1从细胞质区域迁移到细胞膜区域，突变体依赖的GST Pull-down实验和化学合成短肽实验证明了活性Rap1结合在GABAB受体的GB1亚基的C末端氨基酸954-960区域（RVHLLYK），其中带正电荷的氨基酸R954和K960分别与活性Rap1效应子(effector)结合区域中带负电荷的D33和E37有静电作用。接下来我们发现短肽Pep (DGSRVHLLYK)可以在细胞内特异性的阻断活性Rap1与GB1亚基的C末端相互作用，表现出减少GABAB受体介导的IP3积累。同时我们发现了短肽Pep阻断活性Rap1与GB1亚基的C末端相互作用后，会导致GABAB受体在细胞膜上的数目减少，过表达Rap1GAPII也会降低GABAB受体在细胞膜上的数目。利用缺失结合Rap1区域的ΔS953-GB1研究发现，配体激活ΔS953-GB1后，直接导致ΔS953-GB1在细胞膜上的数目减少,然而配体并不减少野生型GB1亚基在膜表面的数目。我们发现GABAB受体的激活会导致持续性的Rap1激活，而且活性的Rap1会结合到GABAB受体的GB1亚基的胞内区C末端，从而起到控制GABAB受体在细胞膜表面活性稳定的作用。这表明GABAB受体介导的Rap1激活对于GABAB受体自身而言是一种正反馈调控机制。