蒌叶和苦豆子抑制细菌耐药性的内应分子发现及其作用机制研究

The antibacterial pharmaceuticals are facing serious drug resistance. Our research intend to discover constituents from Chinese herbs which tackle drug resistance and help antibiotics to inhibit DR bacteria even they do not inhibit growth of bacteria. Our tentative research from Piper bettle have found synergistic constituent zeylenol and (-)-denudatin which down-regulates expression of efflux gene norA in drug resistant Staphylococcus aureus, together with synergistic antibacterial phytochemcals from Sophora alopecuroides. We regard these constituents as Inner Responsive Molecules (IRMs), which do not inhibit the bacterial growth but inhibit drug resistance. We plan (1) to carry out the screening using the synergistic assay to using micro-well checkerboard method to further obtain antibacterial IRMs from P. betle and S. spp plants. (2) chemically modify phytochemical structures for bioactive screening; research on their mechanism of efflux and up-take; to investigate their efficacy on molecular biology level with RT-PCR. (3) to make combination with antibiotics and anti-resistance substances.(4) to explore the feature and mechanism for Inner Responsive Molecules.

抗菌药物面临严重的细菌耐药性。本项目思路是，从中草药中发现本身不直接抑制细菌生长，但抑制细菌耐药性的成分，协同抗生素最终抑制耐药细菌。我们将这种功能的化合物称为内应分子(Inner Responsive Molecules)。这一思路下我们前期研究从筛选量的少量中草药植物蒌叶(Piper betle)中，发现了与抗生素协同作用抑制耐药金葡菌的化学成分zeylenol和下调耐药外排泵基因表达的化学成分(-)-denudatin，以及苦豆子中协同抗菌作用化学成分。在此基础上，本项目计划(1)运用已经建立的协同筛选平台进一步分离蒌叶和槐属植物苦豆子抗耐药菌内应分子；化学修饰部分成分。(2)对协同化学成分进行抗耐药外排泵和RT-PCR等分子生物学实验，研究抗耐药性机制。(3)协同物质与抗生素形成抗耐药金葡菌组合物并进行动物体内实验。(4)探索抗耐药菌内应分子的的特征和作用规律。

一、项目的背景.抗生素对细菌的生长和生存产生抑制和压迫，使得细菌产生变异以抵抗这种生长和生存压迫而产生耐药性。采用对细菌的生长没有抑制作用的化合物阻断细菌耐药性，与抗生素产生协同抗菌作用抑制细菌的生长，这种策略可以避免细菌产生新的耐药性。这类分子我们定义为内应分子。项目以耐药金葡菌为模型，寻找没有直接抑菌活性，从提取物显示活性的中草药苦豆子和蒌叶中发现协同抗生素抑制耐药菌的植物来源天然分子。.二、研究内容、重要结果、关键数据及其科学意义.1. 按计划中完成了苦豆子和蒌叶活性跟踪测试和成分分离。从苦豆子和蒌叶活性部位共分离得到二氢黄酮、新木脂素和苯甲酰环己烯类类型56个化合物，其中新化合物10个，奠定了活性研究的物质基础。.2. 对高速逆流色谱(HSCCC)提出了原位浓缩的概念，从而实现并建立了无限循环高速逆流色谱(UR-HSCCC)实验技术，创新了高速逆流色谱方法，为无损耗分离中草药微量活性成分提供了新的技术基础。研究结果发表在色谱分离领域顶级期刊J Chromatogr A。.3. 分离得到了项目提出的内应分子。筛选发现了四个系列14个作用确实的具有抑制金葡菌耐药性的化合物，并进行了抑制外排耐药性的机制研究。从EtBr荧光外排实验、化合物分子与NorA外排蛋白模拟对接以及RT-PCR实验三个方面研究了部分协同活性化合物的协同作用机制。发现化合物可能通过下调norA基因mRNA表达从而抑制NorA外排蛋白的表达发挥抑制耐药性作用。这一结果解释了化合物作为内应分子抑制耐药性的一种机制。.4. 对2个筛选分离得到的中草药天然单体成分，通过小鼠动物体内实验证明具有协同抗耐药金葡菌作用。与单独使用抗生素相比，槐黄酮与诺氟沙星联合给药显著提高小鼠生存率到70%，同时未发现毒性。这一活性化合物符合项目提出的内应分子的特征。.四年内，在J Org Chem, Int J Antimicrob Ag, J Chromatog A和Phytochem Anal期刊发表研究论文其它期刊共发表论文5篇，申请中国发明专利3项。另外发表相关内容研究论文4篇，前期研究获中国发明专利授权4项。