毛果杨HD-Zip转录因子调控不定根发生和低氮胁迫抗性的分子机理研究

HD-ZIP transcription factor plays important roles in plant growth, development and stress response. In the previous study, we found that two black cottonwood (Populus trichocarpa) homeodomain–leucine zipper (HD-Zip) I genes, which can significantly improve the ability of poplar adventitious root formation and low nitrogen stress resistance. In order to understand the physiological function of the HD-Zip genes, genetic transformation will further be performed to compare with adventitious root development process and low nitrogen stress resistance related physiological and biochemical indices of transgenic poplar with the two genes overexpressed and suppressed. To illustrate the molecular regulatory mechanism of HD-Zip transcription factors during adventitious root formation and low nitrogen stress responses, transcriptome sequencing and chromatin immunoprecipitation–PCR will be applied for identification of downstream pathways and target genes, with functional verification of key target genes through analysis of transgenic poplar. In addition, yeast one-hybrid system and electrophoretic mobility shift assay will be performed for identification of upstream regulatory factors, and yeast two-hybrid system and bimolecular fluorescence complementation assay will be applied for identification of interacting proteins. Consequently, this research provides important theoretical basis and genetic resources for improvement of rooting ability and nitrogen utilization efficiency in poplar.

HD-Zip类转录因子在植物生长、发育和逆境反应中发挥重要作用。在前期研究中，我们挖掘到2个毛果杨HD-Zip基因，其过表达显著提高转基因杨树的不定根发生能力和低氮胁迫抗性。本课题拟继续开展遗传转化研究，对该基因过表达和抑制表达转基因杨树的不定根发育进程和低氮胁迫抗性相关的生理生化指标进行比较，明确其生理功能。同时针对林木不定根发生和低氮胁迫应答中HD-Zip转录因子的分子调控机制不明确的现状，拟开展转录组测序和ChIP-PCR技术筛选下游靶基因以及关键靶基因的杨树转基因功能验证研究、酵母单杂交和凝胶迁移实验筛选上游调控因子研究、酵母双杂交和双分子荧光互补技术筛选互作蛋白研究，以明确HD-Zip转录因子对不定根发生和低氮胁迫抗性的调控机制。项目的完成为杨树生根能力和氮利用效率的改良提供重要理论基础和基因资源。

HD-Zip类转录因子在植物生长、发育和逆境反应中发挥重要作用。迄今，关于杨树HD-Zip类转录因子调控根发育和养分亏缺响应机制的研究鲜有报道。 本项目对杨树组培茎段不定根发生部位的转录组数据比较分析发现，HD-Zip家族基因PuHox52在不定根形成早期显著上调表达。与野生型杨树相比，PuHox52过表达使生根提前1-2天，不定根数量和根的生物量显著提高；而PuHox52抑制表达会使生根时间推迟1-2天，不定根数量和根的生物量明显减少。进行PuHox52过表达株系和WT的组培茎段的不定根发生部位在不定根形成的不同时期的转录组测序。对差异基因进行GO功能注释发现，有大量基因参与到了伤口和激素响应，根系发生发育等进程。利用差异基因构建了PuHox52调控的不定根形成多层层级基因调控网络。通过双荧光素酶、酵母单杂交和ChIP-qPCR等实验鉴定出9个PuHox52的直接靶基因。对2个直接靶基因的转基因功能验证试验结果发现，PuMYC2和PuAGL12过表达促进大青杨不定根发生，而其抑制表达显著降低不定根形成。本项目对原有研究内容进行适当延伸，从多层层级基因调控网络中进一步建立并鉴定了前馈式回路，即PuHox52 ⊣ PuHDA9 ⊣ PuIAA7/PuLBD21/PuWRKY51。发现PuHox52通过抑制组蛋白去乙酰化酶基因PuHDA9的表达，从而提高了转录起始位点附近区域及9个关键调节因子中的3个基因的编码区（PuWRKY51、PuLBD21 和PuIAA7）的H3K9乙酰化水平，导致这3个关键调节因子的表达水平显著提高，从而促进不定根发生。该研究结果进一步支持了PuHox52介导的多层层级基因调控网络能够调控杨树不定根形成的结论。另外，PuHox52在根部受低氮胁迫诱导表达，PuHox52基因过表达显著提高转基因杨树的低氮胁迫抗性，PuHox52抑制表达显著降低杨树低氮胁迫抗性。低氮胁迫下，在PuHox52过表达株系根系中PuNRT1.1、PuNRT3.1B等硝酸转运蛋白等氮代谢相关基因的表达水平显著提高。该研究为提高杨树生根能力和氮素利用效率提供了重要的理论依据和遗传资源。