纳米金刚石生物探针体系的设计和应用研究

Optical biological probe is an important research tool in the life sciences. Due to the low sensitivity and biotoxicity, the traditional fluorescent probes was limited its applications. Raman probe with high sensitivity and water is no effects on the spectral, therefore, it is very suitable for biological environmental testing. Recently, Raman probe based on the surface enhanced Raman scattering effect of dye molecules on noble metal surface,which has a shedding effect and biological toxicity of the dye molecules and high cost of noble metals, limit its applications. Nanodiamond particles, which is good biological compatibility and easy modification, has a characteristic Raman signal, can be studied as a probe of Raman spectra for basic science and biological sensor. Our project aims to establish a new Raman biological probe by using nanodiamond particles. In this project, we will first prepare a nanodiamond stable sol and bonding biological active molecules to it; and then to characteric its original Raman spectra of nanodiamond; to study the features of nanodiamond as a biological probe of Raman spectral; the probe and substrate effects of Raman spectroscopic characteristics and the effect of physiological environment to the probe signal.Finally, we will try to construct a biosensor based on the Raman imaging of nanodiamond as probe.

光学生物探针是生命科学领域重要研究工具，传统荧光探针的低灵敏度、及生物毒性问题限制了其发展。拉曼探针灵敏度高、水对光谱无影响，适合生物环境检测，然而，目前的拉曼探针多是基于染料分子在贵金属表面的拉曼增强效应，染料分子的脱落和生物毒性，及贵金属使用成本，是限制该技术推广的瓶颈。本项目以生物兼容性好，具有特征拉曼信号，易功能化修饰的纳米金刚石颗粒为研究对象，对纳米金刚石探针的拉曼光谱特性进行基础科学研究，并将其用于细胞成像和生物传感器。具体研究内容包括：纳米金刚石稳定溶胶的制备及生物活性分子负载研究；原始纳米金刚石的拉曼光谱特征；金刚石生物探针的拉曼光谱特征；探针与底物作用的拉曼光谱的特征；生理环境对探针信号的影响；底物浓度与探针信号之间数学关系的建立；细胞培养和传感器制备。本项目旨在揭示纳米金刚石生物探针的拉曼特征，研究其在成像和传感器领域应用，为建立新型拉曼生物探针奠定理论和技术基础。

纳米金刚石（NDs）具备合成技术成熟、化学性质稳定、生物兼容性好和表面易于修饰等特性，在生物医学领域，尤其是生物探针、细胞成像、药物载体和癌症治疗等方面都有巨大的发展潜力。本课题聚焦NDs拉曼生物探针体系的构建与应用，依赖共聚焦拉曼生物成像技术，取得如下研究成果：.1．尝试利用NDs稳定而锐利的拉曼信号（1332 cm-1）代替传统的荧光信号，将其作为生物探针，实现在细胞体内的定位和靶向。通过对不同制备方法得到的不同粒径NDs进行评价，最终确定100 nm高温高压法合成的NDs为最佳拉曼生物探针基底材料，生物毒性显示了该种NDs具有良好生物兼容性；.2．利用上述NDs探针，实现在单个活细胞体内对NDs拉曼生物探针的2D、3D拉曼成像及快速定位，并可视化观察了细胞对NDs的内吞过程；同时发现：NDs进入和滞留在细胞内的数量与细胞种类相关，且癌细胞对于NDs的内吞能力明显强于正常细胞。目前的结果为癌细胞识别与肿瘤诊断提供新的思路与方法。.3．NDs拉曼生物探针被表皮生长因子（Human epidermal growth factor, EGF）修饰形成纳米金刚石-表皮生长因子（NDs- EGF）复合物，可以靶向过表达于多种癌细胞表面的EGF受体。借助双通道拉曼成像技术，实现对NDs-EGF复合物与EGFR之间特异性识别过程的可视化观察，同时对NDs-EGF与EGFR识别后所诱发的癌细胞形态变化、迁移能力改变及相关参数的变化关系进行了检测，并对其相关机理进行探讨。.4．选取西妥昔（Cetuximab）代替上述EGF，构建了西妥昔-NDs-顺铂靶向给药体系。这种多功能药物载体有特异性靶向功能，适用于3D拉曼成像，且具备很好的体外抗癌效果。.5.非抗生素类抗菌肽-死亡素被成功修饰在100 nmNDs表面，构建了NDs拉曼生物探针。借助拉曼成像技术，基于NDs的特征拉曼信号（1332 cm-1），可视化了NDs-死亡素复合物与枯草芽孢杆菌间的相互作用。