基于高通量测序的紫花苜蓿盐胁迫差异表达基因在紫花苜蓿耐盐性调控中的功能研究

盐害造成植物减产，严重影响我国乃至世界畜牧业的发展。紫花苜蓿是重要的世界性牧草，了解紫花苜蓿的耐盐分子机理，可以为其抗逆改良提供依据。高通量测序技术（RNA-seq和DGE）能在全基因组内检测和量化转录片段，并能应用于基因组图谱尚未完成的物种，具有分辨率高，应用范围广的优势。本项目利用高通量测序技术，建立紫花苜蓿的转录组数据库，比较盐胁迫和正常生长条件下紫花苜蓿的基因表达差异，寻找紫花苜蓿中的优异耐盐基因，通过Northern Blot、Western Blot等技术研究耐盐候选基因在紫花苜蓿各个器官以及盐胁迫不同时间的时空表达。观察比较候选基因增强前后紫花苜蓿耐盐能力的变化和基因转录水平的变化，研究这些基因在紫花苜蓿耐盐性中的调控作用，深入的了解牧草耐盐基因调控网络，为从分子水平上研究紫花苜蓿乃至牧草耐盐机制打下基础，这将为牧草的耐盐分子育种提供重要的理论依据。

本项目利用高通量测序技术，建立了紫花苜蓿盐胁迫转录组，以该转录组为参考序列，测定了紫花苜蓿在不同盐胁迫时间条件下的表达谱，并利用表达谱数据获得与紫花苜蓿盐胁迫相关的Unigene。通过分子生物学技术和转基因技术，针对有代表性的基因进行了基因功能的分析验证。结果显示，1）以Illumina技术为支持的高通量测序技术可以用于对紫花苜蓿基因资源的挖掘；2）在不同盐胁迫时间盐诱导基因数量和单个基因的累积量不同；3）以WRKY转录因子MsWRKY33、DREB转录因子MsDREB，ABA合成基因MsNCED1，晚期胚胎发育蛋白基因MsLEA1以及bZIP蛋白基因MsZIP为代表的基因在紫花苜蓿的耐盐性调控中发挥重要作用，研究初步解析了紫花苜蓿耐盐调控机理，为耐盐调控基因描述了一个大致的网络轮廓，而且，筛选到了一些用于紫花苜蓿分子改良的候选基因。此外，项目还对紫花苜蓿qRT-PCR分析中使用的内参基因进行了筛选，确定了18SrRNA, Msc27和ACT2为紫花苜蓿qRT-PCR分析的理想内参基因，为紫花苜蓿基因表达分析奠定了基础。