玉米穗粒腐病穗轴抗性主效QTLqRcfv2的图位克隆与功能研究

Maize plays an important role in the national food safety as an important food, animal feed and raw material for industry with 38000000 ha in China. In recent years, Fusarium verticillioide ear rot is one of the prevalent diseases in the world, not only cause serious yield loss, but affect grain quality due to contamination of infected kernels with mycotoxins, which poses a potential threat to animal and human health. The efficiency of cultivating resistant varieties depends on the understanding of genetic mechanism of the resistance to F. verticillioide. There are two forms of resistance to F. Verticillioide ear rot，kernel resistance and cob resistance, in maize. A major QTL qRcfv2 for cob resistance to F. Verticillioide ear rot was identified on chromosome 2 in the different environments by genome-wide association analysis and QTL mapping, which was mapped in 2.7M and verified by NILs. It would be cloned by map-based cloning using a large segregation population with GWAS and whole-genome re-sequencing data and confirmed by subcellular localization, hybridization in situ and transgenic corn plants. It would be helpful to exploring the mechanism of the cob resistance to F. verticillioide and resistant breeding in maize.

玉米是我国主要的粮食作物、饲料作物和重要的工业原料，在国家粮食安全中发挥重要作用。近年来玉米穗粒腐病发病严重，其病原菌产生的真菌毒素，给人、畜安全造成了严重威胁，选育抗病品种的成效取决于抗病遗传规律的了解。课题组把传统意义上的玉米穗粒腐病抗性剖分成籽粒抗性和穗轴抗性，关联分析结合连锁分析，在第2染色体鉴定出一个多环境稳定的玉米穗轴抗性主效QTLqRcfv2,并利用近等基因系进行了验证，初步定位在2.7M区间内。拟进一步构建大分离群体，基于亲本重测序信息开发分子标记，通过交换单株后代测验确定关键交换单株表型，逐步缩小目标区域，结合简化测序的高密度连锁图谱的QTL分析和关联分析等确定候选基因，在转录水平上验证候选基因，进行亚细胞定位，构建过表达和RNAi载体，通过原位转化获得转基因植株，验证候选基因的功能，并通过酵母杂交和ChIP-Seq等技术探索抗性机制，为抗性QTL有效利用奠定基础。

玉米穗粒腐病是世界上普遍发生、危害严重的真菌病害，严重影响了玉米的产量和品质。课题组通过多年的研究将玉米穗粒腐病抗性剖分为籽粒抗性与穗轴抗性。穗轴作为籽粒萌发生长的芽床，它对真菌的抗性能够影响病原菌的侵染和扩散，同时也严重影响玉米的穗收和粒收。试验以籽粒、穗轴高抗拟轮枝镰孢菌的自交系BT-1与穗轴感病的自交系西502为基础，利用 F2群体进行BSA分析，鉴定出了4个QTL；并构建RIL群体进行了连锁分析，共鉴定出了11个QTL；同时结合实验室前期利用F2：3群体对穗轴抗性QTL初定位的结果，将前期已验证的qRcfv2剖分为qRcfv2-1和qRcfv2-2，同时鉴定出一个新的稳定QTL qRcfv3，利用近等基因系（NILs）后代分离群体基因型和表型共分离的策略，将qRcfv2-1的区间缩小至677kb范围内，验证了qRcfv2-2和qRcfv3并将qRcfv2-2的区间定位至2Mb。对258份自交系组成的关联群体进行两年四个环境的穗轴抗性表型鉴定，共鉴定出48个与穗轴抗性显著相关的SNP位点。用抗病自交系BT-1与感病自交系西502进行穗轴抗性的RNA-Seq分析，发现BT-1接种前后发生差异表达的基因有3370个，在西502中有9657个，进一步分析发现BT-1的抗性与水杨酸的合成相关，并且PTI和ETI途径的相关基因在接种后表达上调。结合QTL分析、精细定位、全基因组关联分析和转录组分析，筛选出了5个候选基因。通过对候选基因进行定量分析以及生物信息学分析，初步验证了候选基因的功能。实验首先针对qRcfv2-1区间内的候选基因ZmWDR1进行下一步研究，该基因属于WD40重复蛋白家族，与抗病亲本BT-1相比该基因编码的蛋白在感病亲本西502中缺失了一个甘氨酸。成功构建过表达载体和CRISPR/cas9载体的构建，筛选并发展转基因株系，结合筛选的突变体植株进行候选基因功能验证。通过亚细胞定位将ZmWDR1蛋白定位在细胞核，并通过核系统酵母双杂获得了131个可能与ZmWDR1互作的蛋白，其中包含10个MYB转录因子。同时，对该基因进行候选基因的关联分析，获得3个与穗轴抗性显著相关的变异位点，并在此基础上开发了功能标记。这些结果为进一步探索玉米穗轴抗性分子机制以及抗病分子育种奠定了基础。