利用免疫亲和色谱技术解析芍药苷、甘草酸与芍药甘草汤功效的关联机制

Correlation between the traditional Chinese medcine ingredients and the efficacy is a fundamental scientific issue in the material basis research. This study choose Shaoyao Gancao decoction (SGD), a representative classic formula with definite clinical efficacy ,as the object, and prepare glycyrrhizic acid (GA) and paeoniflorin (PF) immunoaffinity column after getting enough amount of the monoclonal antibody against PF/GA to get the SGD without PF and/or GA, then add in the different dosage of PF and/or GA to get SGD containing assigned dosage of GA and PF. With pharmacological models corresponded to traditional drug efficacy, animal and cell Models were used to compare pharmacological efficacy of SGD between before and after specifically knocking out and re-adding GA and PF. Taking a combination of in vivo and in vitro, static and dynamic, efficacy and biological indicators as evaluations criteria , the contributions and relationship in efficiency- the amount of GA and PF on analgesia, spasmolysis, anti-inflammatory, liver protection effects of SGD will be analyzed. And the effects of interation of GA and PF on efficacy of SGD will be also analyzed. The study will provide a new idea for effective components of Chinese herbs and a novel technology and method for metabolism in vivo and finding targets of similar prescription.

中药（复方）的化学成分与其整体功效之间的关联性是中药药效物质基础研究的基本科学问题。本研究选择临床疗效确切的代表性经方芍药甘草汤为对象，制备芍药苷和甘草酸免疫亲和色谱柱，获取分别敲除了芍药苷、甘草酸的芍药甘草汤，以及同时敲除了二者的芍药甘草汤，进而通过“敲入”（定量添加），获取芍药苷、甘草酸不同含量的芍药甘草汤，借助与该药传统功效主治相应的现代药理模型，采用动物/细胞模型，通过离体、在体，静态与动态，药效学与生物学指标相结合的评价标准，比较特异性敲除及回填芍药苷、甘草酸前后的芍药甘草汤水提物发挥药理药效的异同，探讨芍药苷、甘草酸对芍药甘草汤镇痛、解痉、抗炎、保肝作用影响的量效关系，以及芍药苷与甘草酸的交互作用对芍药甘草汤功效的影响。本课题将为中药物质基础的研究，有效成分的确定提供新的思路，并为同类复方的体内代谢、作用靶点寻找等研究提供新的技术与方法。

本研究选择经方芍药甘草汤为对象，分别建立了芍药苷和甘草酸单克隆抗体的免疫亲和色谱柱，优化了敲除、洗脱条件。利用甘草酸免疫亲和色谱柱，可敲除芍药甘草汤中的甘草酸及与其结构类似的三萜皂苷类成分，回填甘草酸后获得不同比例甘草酸的芍药甘草汤溶液，用于LPS干预的HUVEC细胞炎症模型，与模型组相比，含100%甘草酸的芍药甘草汤组及甘草酸组对IL-6和TNF-α的含量都有显著降低（P<0.05），且TNF-α可降至与空白组相当水平，而其他甘草酸含量不同组对IL-6和TNF-α的影响均不显著，说明甘草酸对抗炎作用的贡献度最大。.体内代谢研究表明芍药甘草汤中芍药苷Tmax为60 min左右，芍药单药组为40 min左右。在芍药甘草汤中甘草量小于或等于芍药量时，芍药苷Cmax随着甘草量的增加而增加，当甘草量大于芍药时，芍药苷Cmax则下降，在芍药甘草比例1：1时，芍药苷Cmax最高。另外，发现蜂蜜与甘草提取物或甘草酸单体联合给药后，小鼠血液中甘草酸的血药浓度达峰时间有所延长作用，在一定程度上验证了“甘则缓之”中医理论，且这种延长作用很大可能是蜂蜜中的果糖引起的。.运用中药小分子免疫亲和色谱柱技术研究甘草酸、芍药苷对芍药甘草汤镇痛、抗炎作用的贡献度，采用小鼠热板法致痛模型和二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型，从“量-时-效”关系的角度综合分析芍药甘草汤配伍机制，结果发现：①甘草量小于等于芍药时，对芍药苷的溶出量抑制不显著，对芍药苷的体内吸收有促进作用；当甘草量大于芍药时，对芍药苷的体外溶出和体内吸收均表现出明显抑制作用。②甘草使芍药甘草汤镇痛起效时间延迟，镇痛作用时间延长。③芍药甘草汤发挥镇痛与抗炎药效的最佳配伍比例不同。芍药甘草汤（1：1）抗炎作用与甘草酸相似，但无论甘草酸比例增加或减少都抑制了整体的抗炎作用。说明活性成分在中药复方中与其他成分之间发生相互作用，也存在最佳配伍比例，而并非成简单的线性关系。.本课题为中药物质基础的研究、有效成分的确定提供了新的思路和研究模式。