基于NanoPCR的登革热病毒现场可视化基因分型与检测

In recent years, the incidence of dengue fever is increasing, and the damage is significant. There is no specific antiviral treatment currently available for dengue fever. Only, some measures can be taken as a supportive care in dengue fever. Therefore, significant attention has been drawn to finding a suitable and simple point-of-care (POC) combination tests capable of detecting Dengue virus (DENV) markers rapidly and accurately at different stages of DENV infection. To meet the requirement for quick and accurate diagnosis and genotyping of DENV, the applicant has designed a protocol that will take benefit of the latest advancement in the field of molecular techniques based on magnetic separation technology, Nano-PCR, and Gold nanoparticle for the generation of a visual signal detection. This genotyping and detection technique of dengue virus gene based on Nano-PCR has the characteristics of rapid processing, high sensitivity, and visual signal detection; and the whole process is carried out in one tube. The whole protocol can be packed into a fully automated miniaturized machine, easily portable to the field. The development of this technology will provide a new diagnostic strategy for dengue virus infection and provide a technical basis for monitoring and preventing the outbreak of dengue fever in grass-roots communities.

近年来，登革热病发病率日益增加，危害显著。目前市场上没有针对登革热的特效抗病毒治疗方法，只有一些辅助治疗措施来缓解登革热病的症状。因此，若能发展一种能快速、准确地诊断不同阶段登革病毒感染的现场检测技术，可以帮助感染者在早期采取治疗措施，减轻登革热病的症状及死亡率。为了满足快速、准确的诊断和分型登革病毒的要求，申请人基于磁分离技术、Nano-PCR及金纳米粒子，设计了一个新的能显著提高检测效率的登革热病毒核酸信息可视化检测方案。基于Nano-PCR的登革热病毒基因分型与现场可视化检测技术不仅具有快速、灵敏度高及可视化等特点，而且整个检测过程可在同一管中进行，易于实现自动化和野外现场检测. 该技术的发展将为登革热病毒感染提供新的诊断策略，为基层社区监控和预防登革热病的爆发提供技术基础。

磁性纳米粒子（MNPs）由于其制备方法简单、生物相容性好、具有超顺磁性及可在外磁场下操作，在生物医药研究领域的应用而引起了广泛关注，如局部给药、细胞分离、核酸提取和生化产物分离等等。本课题结合用于核酸提取的磁性分离技术，高效且特异性扩增靶基因的RT-PCR（逆转录酶聚合酶链式反应）以及探针修饰的金纳米颗粒杂交，以实现 DENV 的快速和现场检测和基因分型。首先，我们从 NCBI 检索 DENV 的四种基因型的基因组，使用不同的算法对这些基因组进行比对，以确定这些基因组中的保守区域，并依此设计了DENV的引物、探针以及模拟序列，并通过优化、筛选及实验验证，得到了目的核酸序列。其次，课题组研究了多粒径磁性纳米粒子的超快速合成研究，并致力于探讨了氢氧化钾在磁性纳米粒子包硅中的作用，结果显示采用新的方案5分钟内可以完成硅烷化，大大提高了硅烷化磁性纳米颗粒的合成效率，为其产业化建立了很好的技术基础。进而，我们利用合成的磁性纳米粒子研发了2种核酸提取试剂盒，试剂盒在全自动核酸提取仪的配合下，可以在12分钟内高效完成核酸提取，其检测灵敏度可以达到50 copys，完全满足登革病毒和新冠病毒检测的需要，并大大缩短了病毒核酸检测的时间，相关产品已经推向市场。最后，我们初步探讨了MNPs和AuNPs与登革病毒PCR技术的相互作用，初步验证了NanoPCR的可行性。综上结果，本研究为建立登革病毒快速检测技术开发奠定了坚实的工作基础。项目资助发表SCI收录论文3篇，已接受待发表2篇，申请发明专利2项，培养博士后1名。项目投入经费28.8万元，直接经费结余经费4.7747万元，结余经费计划用于本项目研究后续支出。