卷柏属炔多酚类成分的立体结构及抗真菌活性研究

从天然产物中寻找高效低毒、结构新颖、作用机理独特、能够逆转真菌耐药性的新化学实体成为医药行业迫切的任务。申请者多年来从事中国卷柏属植物的化学成分及其活性研究，发现其中炔多酚类成分Selaginellins具有较好的抗真菌及逆转真菌耐药性的活性。然而，迄今发现的Selaginellins均以消旋体的形式存在，其立体构型未能阐明是以往研究的缺憾。本项目拟对Selaginellins进行拆分，并进行体内、外活性评价，在明确其立体构型与活性的相关性的基础上，研究其对真菌细胞膜麦角甾醇生物合成通路的干预，确定其作用的关键酶和基因；并拟从Selaginellins对真菌耐药性起关键作用的耐药蛋白Cdr1p影响的角度，阐明其逆转耐药的机制。本研究综合运用立体化学、分析化学、药理学、微生物学及分子生物学的研究方法，旨在发现新型抗真菌药物先导化合物，为进一步的结构改造奠定基础。

本项目在前期研究的基础上，进一步完成了卷柏药材中selaginellin类化合物的系统分离研究工作，丰富其化学多样性；并研究了这一系列selaginellin类化合物对临床常用真菌的抑制作用，发现其均有一定程度的抗真菌活性。通过单晶X-衍射，手性拆分等方法，首次揭示了selaginellin类化合物以消旋体形式存在的内在机制：互变异构现象和旋转受阻现象。建立了其中旋转受阻类selaginellins的手性拆分方法，并用量子化学计算的方法确定其绝对构型。同时进行立体构型与抗真菌活性相关性的研究：拆分得到的对映异构体室温下不稳定，发生消旋化。因此对于拆分前后化合物的活性比较，只是反映了一个趋势，尽管如此，拆分后的两对对映异构体对白色念珠菌的抑制活性较消旋体提高了1~2倍，对熏烟色曲霉的抑制活性提高了1倍，即单一构型的化合物的活性确实高于消旋体。鉴于手性拆分的成本，及目前活性筛选技术的限制，本研究没有从此方面深入进行；转而从寻找抗真菌药物增效剂的方面着手，发现selaginellin具有较好的对唑类药物体外抗白念珠菌的增效作用。采用RT-PCR，Western blot，流式细胞术，生化检测技术，及棋盘式微量液基稀释法考察还原剂的加入对两药协同效果的影响，探讨二者协同抗白念珠菌的机制，结果显示两药合用显著上调Sirt2，对凋亡的影响不明显，阻滞细胞周期于S期，线粒体有氧呼吸增强，ATP 生成量减少，ATP 合酶活性受到抑制，内源性活性氧（ROS）生成大量增加。初步推断二者合用是通过阻滞白念珠菌细胞周期，增强白念珠菌的能量消耗、抑制 ATP 合酶活性使细胞内 ROS 生成增多，促进氧化损伤而杀伤白念珠菌。这一“活性氧机制”可能是其协同抗白念珠菌的重要分子机制之一。Sirt2在selaginellin和氟康唑协同抗白念珠菌的机制中的作用，以及与“活性氧机制”的相关性有待进一步研究。同时针对卷柏属植物selaginellin的分布，及selaginellins的细胞毒活性进行了延展性研究。