E3连接酶RNF148调控抑癌基因CHAC2在结直肠癌发生发展中的作用及机制研究

The E3 ubiquitin ligases of Ubiquitin-Proteasome System (UPS) regulate the cell growth, migration, apoptosis and other important cell physiological processes by degradating their target proteins. In our preliminary work, we have found that the protein expression of E3 ubiquitin ligases RNF148 was negatively related to that of tumor suppressor CHAC2 in colorectal cancer tissues, and tightly related to clinicopathological parameters of patients. In colorectal cancer cells, RNF148 and CHAC2 can co-immunoprecipitate with each other. Colorectal cancer cells with RNF148 overexpressed significantly promoted cell migration, whilst inhibited the cell apoptosis. All these results strongly indicated that RNF148 play important roles in cancer development and progression through degradation of tumor suppressor CHAC2. Thus, we aim to investigate the molecular mechanisms of RNF148 in regulating CHAC2. We further clarify the role and mechanisms of functional domains of RNF148 and the posttranslational modification of CHAC2 in the interaction between CHAC2 and RNF148, and the ubiquitination degradation of CHAC2. The study will explicate the role and mechanisms of RNF148 in colorectal cancer development and progression, and identify RNF148 as an important colorectal cancer pathogenic factor, providing new idea and potential target for colorectal cancer diagnosis and treatment.

泛素-蛋白酶体途径中的泛素连接酶E3，通过调控其靶蛋白参与调节细胞的增殖、迁移和凋亡等重要细胞生理过程。我们前期研究发现，E3泛素连接酶RNF148在结直肠癌组织中的表达水平与抑癌基因CHAC2的蛋白表达水平呈负相关，并与患者的临床病理表现密切关联；在结直肠癌细胞中，RNF148与CHAC2可相互作用；高表达RNF148能促进肿瘤细胞迁移并抑制其凋亡。这些结果强烈提示RNF148可通过泛素化降解CHAC2，在结直肠癌发生发展中发挥重要作用。因此，本项目将研究RNF148调控CHAC2的具体分子机制，重点阐明RNF148起作用的重要结构域和CHAC2的翻译后修饰在介导CHAC2与RNF148相互作用及其泛素化降解中的功能，同时明确RNF148在结直肠癌发生发展中的作用及其机制，鉴定RNF148为结直肠癌的重要致病因子。研究结果将为结直肠癌的诊断和干预提供新思路和潜在的新靶点。

泛素-蛋白酶体途径中的E3泛素连接酶，通过调控其靶蛋白的泛素化降解，参与调节细胞的增殖、迁移和凋亡等重要细胞生理过程。我们前期研究发现，E3泛素连接酶RNF148在结直肠癌组织中的表达水平与抑癌基因CHAC2的蛋白表达水平呈负相关，并与患者的临床病理表现密切相关，其分子机制尚未明确。本项目深入研究了RNF148调控抑癌基因CHAC2在结直肠癌发生发展中的作用机制；重点阐明了RNF148起作用的重要结构域和CHAC2的翻译后修饰在介导CHAC2与RNF148相互作用及其泛素化降解中的功能；从而明确了RNF148在结直肠癌发生发展中的作用机制。.通过体内外实验发现：（1）RNF148在大部分结直肠癌组织中的表达水平高于癌旁正常组织；根据RNF148蛋白表达水平绘制结直肠癌患者的生存曲线发现，RNF148蛋白的表达水平与结直肠癌患者的总生存期显著负相关，与大部分临床病理参数显著相关；（2）平皿单克隆形成实验、划痕实验、Transwell实验、CCK-8实验、流式细胞术结果表明，RNF148能显著增强结直肠癌细胞的平皿单克隆形成、划痕愈合和迁移能力，抑制细胞凋亡比例以及对 5-FU的敏感性；（3）裸鼠皮下成瘤实验结果表明，过表达RNF148能够促进裸鼠体内结直肠癌细胞的增殖；（4）免疫共沉淀、Western blot、免疫荧光结果表明，RNF148与CHAC2可相互结合，并且RNF148-PA结构域、CHAC2-Chac结构域是二者相互结合所必须的结构域；改变RNF148的表达水平能显著影响CHAC2蛋白的泛素化降解；（5）LC-MS鉴定了CHAC2蛋白的多个磷酸化和泛素化位点，进一步通过缺失突变表明，CHAC2蛋白第237位赖氨酸是其核心的泛素化修饰位点；（6）免疫共沉淀和LC-MS分析与CHAC2和RNF148结合的蛋白发现，结合蛋白与蛋白质折叠和内质网应激反应密切相关。本项目鉴定了RNF148 为结直肠癌的重要治病因子，为基于RNF148的结直肠癌诊断和干预提供新思路和潜在的新靶点。