Sox9转录调节ABCG2在肝细胞癌耐药性中的作用和机制研究

Hepatocellular carcinoma(HCC), a major kind cancer mainly cause by hepatitis virus infection, is characterized by a higher rate of recurrence. Effective preventive measures of recurrence are very few, and lack of effective drug treatment for HCC therapeutic targets so far. Our previous studies have demonstrated transcriptional regulation of ABCG2 by Sox9 plays an important role in drug resistance in HCC. But the mechanism remains to be further explored. To this end we propose the hypothesis: Sox9 can increase hepatocellular carcinoma cells resistant by regulating the expression of ABCG2. To verify this hypothesis, we will use immunohistochemistry, Western blot, immunoprecipitation, ChIP and related molecular biology and cell biology to study ABCG2 and Sox9 expression in HCC and correlation with liver cancer prognosis, Sox9 hepatoma cells affecting the regulation of ABCG2 function and relationship of methylation of Sox9 and expression of ABCG2, and systematic analysis of Sox9 in the role of liver cancer cell growth, to further clarify Sox9 regulating ABCG2, clarify its resistance in the liver cells the importance of medicinal aspects of research Sox9 regulatory mechanisms regulating ABCG2, a clear increase Sox9 specific mechanisms by ABCG2 resistant hepatoma cells. Collectively, this study will provide potential new strategies and possible targets of liver cancer recurrence.

原发性肝癌是一种肝炎病毒感染为最主要病因的主要恶性肿瘤，以复发率较高为主要特点。迄今仍缺乏有效的抗复发方法，肝癌的综合或药物治疗缺少有效的靶点。预实验提示Sox9转录调节ABCG2在肝癌耐药性中起重要作用。但其机制还有待探讨。为此我们提出假说：Sox9可通过调控肿瘤细胞中ABCG2的表达来提高其的耐药性。为验证该假说，我们将采用免疫组化、免疫印迹、免疫共沉淀、ChIP等分子生物学和细胞生物学方法研究Sox9和ABCG2在肝癌组织中的表达变化以及同肝癌预后的相关性，Sox9通过ABCG2调控肝癌细胞耐药性及Sox9甲基化对ABCG2表达的影响，并对Sox9在肝癌细胞生长中的作用进行分析，进一步明确Sox9调节ABCG2，阐明其在肝细胞耐药性的重要性，研究Sox9调控ABCG2的机制，明确Sox9通过ABCG2提高肝癌细胞耐药性的机制。本研究将为预防肝癌术后复发提供潜在的新策略和可能的靶点。

索拉菲尼是进展期肝细胞肝癌为数不多的药物之一，但其广泛存在的耐药性限制了患者的获益。近年来的研究提示肿瘤干细胞的存在与肿瘤耐药有着密不可分的关系，而SOX9即为HCC肿瘤干细胞的重要标志物。本课题探索了SOX9参与HCC对索拉菲尼耐药的过程，并且明确了Sox9通过AKT/BCRP(ABCG2)通路调控HCC对索拉菲尼耐药的具体生物学机制，从而为解决HCC对索拉菲尼耐药提供潜在的方法，丰富进展期HCC治疗的手段。首先，在对HCC细胞系使用索拉菲尼处理后发现SOX9表达增高，并且SOX9阳性表达细胞比例增加。其次，使用慢病毒构建干扰和过表达SOX9的稳定细胞株，在体外通过检测使用索拉菲尼后细胞的增殖及克隆形成能力，细胞凋亡水平明确了过表达SOX9可以增加HCC对于索拉菲尼的耐药性，随后通过小鼠肿瘤肺转移模型，并通过索拉菲尼灌胃治疗的方法在体内实验中亦证明了该结论。之后我们通过在细胞内过表达SOX9并使用表达谱芯片的高通量手段筛选发现了与索拉菲尼耐药紧密相关的AKT/BCRP(ABCG2)通路，随后通过免疫印迹，免疫荧光实验明确SOX9，AKT通路激活及BCRP(ABCG2)表达之间的正相关关系。最后我们通过构建过表达SOX9同时敲减BCRP(ABCG2)表达的细胞株来进行拯救实验，通过检测在索拉菲尼处理下的细胞增殖能力、克隆形成能力、凋亡水平，明确SOX9通过BCRP(ABCG2)增加肝癌细胞对索拉菲尼的耐药性的分子机制。最后我们选取了术后行索拉菲尼治疗的患者的组织样本，通过免疫组化检测SOX9表达，并通过KM曲线，回归分析的统计学方法证实了SOX9表达阳性的病人肿瘤无进展时间更短，预后更差，SOX9表达阳性是服用索拉菲尼病人预后的独立危险因素。