一种可完全去疤的具有可逆末端终止测序功能的核苷酸类似物的研究

Sequencing using reversible terminator is a new second-generation high-throughput DNA sequencing technology with higher market share and great promise. It belongs to "Sequencing by synthesis" using polymerase primer extension as its core biochemistry. Traditional reversible terminator nucleotide analogs leave behind a vestige ("scar") after cleavage of the linker carrying the fluorophore. During repeated cycling, these scars accumulate on the growing primer, lowering duplex stability and impeding with further primer extension. This limits the overall read length of the sequencing process. To achieve the long read length of "reversible-terminator sequencing" architecture, we design and plan to synthesize a "Scarless reversible terminator" having a special linker holding a fluorescent tag that, after being read, can be cleaved to leave behind no "scar". Here the commercial DNA polymerases and reverse transcriptases will be first screened for their ability to well primer extension with only one scarless reversible terminator and then stop the reaction. Furthermore, to get the better enzymes to accept the scarless reversible terminator, we plan to construct several REAP polymerase libraries using "Reconstructed evolutionary adaptive paths (REAP)" approach. During this process, the REAP approach as a new methodology to construct functional protein mutant library will be further enriched and improved.

可逆末端终止测序技术是目前市场占有率较高应用前景较被看好的一种二代高通量测序技术。它属于合成测序法，利用DNA聚合酶链延伸反应，边合成边测序。传统的具有可逆末端终止功能的核苷酸类似物在引物上合成延伸测序过程中，切除荧光基团之后，都会在碱基上残留一部分连接臂（疤痕）。这种带有疤痕的dNTPs在引物上延伸累积，会破坏DNA双螺旋结构的稳定性，影响其在引物上的延伸和测序读长。基于可逆末端合成测序法的读长短的这一缺点，本项目设计一种可完全除疤可逆末端终止功能核苷酸，使其能够在引物上更高效地合成延伸和有效终止，从而实现可逆末端终止测序法的长读长。另外，本项目拟通过对商业化酶以及"重建自适应进化路径"手段所建库的筛选，获取高效延伸、有效终止可完全去疤可逆末端终止功能核苷酸的酶；同时也进一步在方法学上丰富和完善应用"重建自适应进化路径"设计构建蛋白突变库获取特殊功能蛋白的手段和策略。

可逆末端终止测序技术是目前市场占有率最高应用前景较被看好的一种二代高通量测序技术。它属于合成测序法，是利用DNA聚合酶链延伸反应，边合成边测序。现有的可逆末端终止功能的核苷酸类似物在引物上合成延伸测序过程中，切除荧光基团之后，都会在碱基上残留一部分连接臂（疤痕）。这种带有疤痕的dNTPs在引物上延伸累积，会破坏DNA双螺旋结构的稳定性，影响其在引物上的延伸和测序读长。基于可逆末端合成测序法的读长较短的这一缺点，本项目设计一种可完全除疤可逆末端终止功能核苷酸，使其能够在引物上更高效地合成延伸和有效终止，从而实现可逆末端终止测序法的长读长。本研究建立并完成了可完全去疤可逆末端终止功能核苷酸的合成工作，并对反应条件进行了优化，建立了产率较高且原子经济好的绿色制备方法；可被完全切除的连接臂（可完全去疤）是本研究的核心和重点，对连接碱基与荧光基团的邻二醇基可切割连接臂的去疤效果的检验结果表明，在较温和的反应条件下即可以完全去除碱基上的丙醛基，完全去疤率可达98-99%，达到本项目的预期目标；本研究通过单侧引物延伸实验，从多种DNA聚合酶和逆转录酶中筛选选获取了多种高效延伸及有效终止完全去疤可逆末端终止功能核苷酸的酶；在上述成果的基础上，我们借助于醛基芯片，初步建立了完全去疤可逆末端终止功能核苷酸多步引物延伸、终止、读取、切除实验流程，碱基读取正确率超过95%，为下一步实现此完全去疤可逆末端终止功能核苷酸及其酶在测序技术的应用奠定了基础。