细胞囊泡转运包被包被复合体COPI的组装与分子调控

Eukaryotic cells exchange material between cellular compartments by vesicle trafficking, which is responsible for cellular homeostasis. The formation of these vesicles is initiated by recruiting cytosolic coat proteins to donor membrane and their following assembly into cargo-structure. COPI-coated vesicles play major roles in sorting cargoes from cis-Golgi network back to endoplasmic reticulum or within Golgi Eukaryotic cells exchange material between cellular compartments by vesicle trafficking, which is responsible for cellular homeostasis. Coat proteins play a key role in intracellular transport as core machines, with two major functions, binding to cargoes for the proper packaging and bending membrane that generates transport vesicles. The ADP-ribosylation factor (ARF) family of small GTPases has been shown to regulate these function of coat proteins by dictating their recruitment from the cytosol to membrane. COPI-coated vesicles play major roles in sorting cargoes from cis-Golgi network (CGN) back to endoplasmic reticulum (ER) or within Golgi apparatus. Before recruitment by Arf1，coat proteins for COPI are pre-assembled as a single soluble protein complex in the cytoplasm, termed coatomer. The structure of membrane bound coatomer in COPI coats is reported，however the substantial conformational flexibility of cytoplasmic coatomer hinders in depth understandings of its three dimensional structural details. And the mechanism of how coatomer changes its conformation from cytosolic state to membrane state remains unclear. Here，we aim to study three dimensional structures of coatmer in cytosolic state and membrane bound state, scaffold subcomplex and adaptor subcomplex, and their interactions with cargo, Arf1 and ArfGAP1, to investigate the conformational transition of coatomer and functional mechanism in the formation of COPI vesicle.

囊泡运输是真核细胞特有的物质运输方式，对维持细胞稳态至关重要。包被蛋白是参与囊泡运输的中心机器，它可以正确识别货物分子，并诱导细胞膜变形形成囊泡。小G蛋白Arf负责将包被蛋白从溶液中招募到细胞膜上组装形成复合体。COPI小泡介导从顺面高尔基体网状区到内质网及高尔基体囊膜内部之间的物质运输。在被Arf1招募到高尔基体膜上之前，COPI小泡的包被复合物在溶液中预组装为一个异源七聚体，即包被蛋白复合物coatomer。虽然COPI在膜上三维结构已经解析，但由于其在溶液中的构象多变，其三维结构一直无法解析；如何从溶液中的构象转变为膜上包被中的构象，其机制并不清楚。本项目拟利用冷冻电镜单颗粒技术和冷冻电子断层技术，研究包被蛋白复合物在溶液状态、膜结合状态的三维结构、骨架亚复合物和接头亚复合物的高分辨率结构、以及其与货物分子和调节因子Arf1、ArfGAP1的相互作用，阐明COPI小形成的分制。

COPI小泡介导从顺面高尔基体网状区到内质网及高尔基体囊膜内部之间的物质运输。在被Arf1招募到高尔基体膜上之前，COPI小泡的包被复合物coatomer在溶液中预组装为一个异源七聚体，由于它在溶液中构象多变，其三维结构一直无法解析。它如何从溶液中的构象转变为膜上包被构象的机制也并不清楚。本项目拟利用冷冻电镜单颗粒技术和冷冻电子断层技术，研究coatomer在溶液状态、膜结合状态的三维结构，阐明COPI小泡形成的分子机制。. 2018年，我们做了大量的生化实验，研究coatomer与脂质体的相互作用，并研究不同长度的PA是否可以促进COPI小泡的形成。我们发现coatomer的两个亚复合物在溶液中存在相对运动，因此样品不稳定。为了解决这个问题，我们设计了一系列新的构建，如将γ和β’融合表达，以锁定两个亚复合物之间的相互作用，或截去各亚基上的柔性区域等，但是最终都没有获得更为稳定的样品。同年与我们竞争的国外研究组发表文章用电子断层-体数据平均（Subtomogram averaging）的方法将COPI有被小泡作为整体连同小泡的膜组分一起进行了三维重构，得到了9埃分辨率的结构，基本回答了我们想要回答的问题。因此，我们及时调整了研究方向，进行介导非囊泡运输的磷脂转运蛋白复合物Ups1/Mdm35的结构与功能研究。. 心磷脂是线粒体膜上标志性的磷脂分子，它在维持线粒体正常形态和功能上发挥着重要的作用。心磷脂以PA为底物在线粒体内膜的基质侧合成。然而，PA主要是在内质网上合成的，所以PA需要从内质网被转运到线粒体内膜上。在酵母中，线粒体膜间隙蛋白复合体Ups1/Mdm35被发现能够转运PA。我们通过解析Ups1/Mdm35结合与不结合PA的3个晶体结构，在全原子分子动力学模拟，精细的结构比较的基础上，首次提出了Ups1/Mdm35与膜相互作用的精细构象变化模型，并设计了一系列实验进行验证。文章发表在Nature子刊 Communications Biology上。. 申请人为表达纯化COPI复合物所开发的SmartBac杆状病毒表达系统，已经申请了国家发明专利（申请号：201810028508.0）。 2020年7月6日，该项专利申请PCT入美国，申请号是16960227。