miRNA表观遗传修饰调控和抗肝纤维化分子机制的研究

microRNA（miRNA）是一类长约22nt的内源性非编码RNA，具有调节发育和内源基因表达的功能，是潜在治疗肝纤维化的基因武器。目前miRNA的研究集中于miRNA表达谱的改变以及纠正异常的miRNA治疗肝纤维化，而对miRNA的调控机制以及作用机制缺乏研究。本课题通过DNA甲基转移酶抑制剂干预肝星状细胞（HSCs）后，检测miRNA含量、DNA甲基化水平和HSCs活性的改变来建立它们之间的三维图谱及其相互作用的调控网络，阐明表观遗传修饰调控对miRNA和HSCs活性的影响，为完善一个多通路、多层次的基因调控网络以解析肝纤维化的发生和发展奠定基础。另外我们用生物信息学方法预测出miRNA的靶基因，然后通过报告基因实验和体外实验进行验证以确保靶基因的正确性，这有助于阐明miRNA抗肝纤维化的分子机制，为防治肝纤维化提供新思路和新策略。

microRNA是治疗肝纤维化的潜在基因武器。目前对miRNA的调控机制以及作用机制缺乏研究。我们用DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza干预肝星状细胞（HSCs）后，发现HSC的增殖和活性受到明显抑制。深入研究发现，miR-29b启动子甲基化率较高，为65.45%，但经过5-Aza作用后，甲基化率仅为7.27%，提示5-Aza参与了miR-29b的去甲基化过程。另外，miR-29b尚可作用于DNA甲基转移酶3b而引起PTEN甲基化水平下降，继而引起PTEN表达水平升高，从而达到治疗肝纤维化目的。我们的研究还发现，Ⅳ型胶原和Sp1是miR-150的靶基因，而Sp1是Ⅰ型胶原上游信号分子，因此miR-150通过直接作用于Ⅳ型胶原和间接作用于Ⅰ型胶原而治疗肝纤维化作用。此外，PTEN是miR-181b的靶基因，miR-181b通过降低PTEN进而促进PI3K/Akt信号通路而促进肝纤维化进展。最后，我们发现TGF-βⅠR是miR-29b的潜在靶点，miR-29b通过降低TGF-βⅠR而治疗肝纤维化作用。随着研究的深入，我们在原计划的基础上进行了合理的拓展和深入。①miRNA的其他调控研究。我们构建了Dicer siRNA，发现跟肝纤维化相关的miR-138，143，140和122发生了改变，肝星状细胞的增殖和激活受到了抑制，因此我们认为Dicer通过miRNA可以影响肝纤维化进程。②miRNA的靶向治疗。构建具有靶向性、高转染效率的载体是基因治疗的关键。我们成功的构建了TGF-βⅡR单链抗体。跟脂质体相比，我们发现单链抗体携带miR-29b具有更高的转染效率和更强的抗肝纤维化效果。此外我们对壳聚糖也进行了研究。我们发现纳米壳聚糖具有较高的转染效率，携带miR-29b具有较好的抗肝纤维化效果。③血清miRNA作为肝癌的诊断指标。 肝纤维化/肝硬化的重要并发症是肝癌，因此需要进一步阐述miRNA能否作为判断肝癌预后的指标。我们发现高水平的miR-17-5p患者往往预后差，容易复发。此外，我们还发现血清miR-29b有助于原发性肝癌的诊断和预后估计。最后，《RNA干扰治疗肝纤维化的机制研究》还获得了浙江省高校科研成果奖三等奖（排名第2），担任《肝纤维化研究前沿》书籍学术秘书，这些工作为肝纤维化治疗奠定了坚实的基础。