疟原虫TatD-like DNase 在蚊虫期表达规律及阻断传播潜力研究

Malaria is one of the diseases that post most threat to human health. Due to the reason the Plasmodium parasites have gradually developed resistance to most of the anti-parasitic drugs, malaria vaccine has been regarded as the most effective tool to control the disease. The purpose of this study is to dissolve the immune evasion mechanism of the malarial parasites. In the previous studies, we have found that malarial parasites utilize the TatD-like DNase to counteract the immune cell-derived extracellular DNA trap. Here in this study, we will use immunological and molecular biological approaches to further investigate the expression of the molecule in the mosquito stages of the parasites and its correlation with the transmission capacity. Furthermore the amino acid sequences of TatD-like DNases of various isolates will be compared and sequence conservation determined. Lastly, antibodies of individuals of complicated and uncomplicated malaria to TatD-like DNase will be investigated and correlation of the antibody responses to the molecule and clinical protection will be established. The study will be of great importance to the development of a novel malaria vaccine.

疟疾是对人类危害最为严重的传染病之一，由于虫体不断产生耐药性，抗疟疫苗被认为是最好的防控手段，但疟原虫与宿主免疫系统的作用机理一直不是很清楚。本课题组前期研究发现：疟原虫TatD-like DNase是介导虫体逃避宿主先天性免疫清除的重要功能抗原。因此，本课题将继续围绕疟原虫与宿主免疫系统作用机理这一关键科学问题，在前期研究结果的基础上，采用分子生物学等先进手段进一步分析疟原虫TatD-like DNase在蚊虫期表达规律及与传播的相关性。深入分析不同虫体分离株TatD-like DNase分子间氨基酸的保守性并确定目标区域，进行体外表达。以不同临床症状的疟疾患者血清研究宿主对该蛋白质的免疫应答和宿主抗感染免疫的关系。以该蛋白质免疫动物，再采用蚊虫叮咬的方式攻虫，研究免疫动物对虫体感染的免疫力。该项研究结果对揭示疟原虫逃避宿主的先天性免疫机理及发掘新型抗疟疫苗候选抗原具有重要的意义。

疟疾是一类由疟原虫所引起的人兽共患疾病，呈世界范围流行，据世界卫生组织统计每年有45万人死于疟疾、2亿人受到该疾病威胁。随着近些年抗疟药物的大规模推广以及杀虫剂的大面积使用，在东南亚以及非洲疟疾流行地区，已经有大量抗药虫株出现。由于目前新型抗疟药物的研制处于瓶颈阶段，所以疟疾疫苗被认为具有消灭疟疾的潜质。.本实验室已经证明了疟原虫TatD-like DNase是一类参与疟原虫免疫逃避的相关毒力因子，并且以其作为抗原免疫小鼠可以有效抑制无性阶段伯氏疟原虫的生长发育；所以本课题以TatD-like DNase为研究对象，对其在有性阶段的表达情况进行研究，并对其在各流行地区的保守性进行分析，并以此为基础，对该蛋白质作为候选抗原的保护效果与传播阻断效果进行综合分析。.本课题的主要研究成果主要包括以下几方面：利用制备出的多克隆抗体确定了TatD-like DNase在恶性疟原虫配子体时期，伯氏疟原虫配子体时期、动合子时期表达在虫体细胞膜周围；证明了抗伯氏疟原虫TatD-like DNase血清可以显著降低感染小鼠血液中的配子体率，有效抑制雄配子出丝率、动合子与子孢子在蚊体内的形成数量；利用qPCR技术证明了疟原虫TatD-like DNase基因转录水平与虫株毒力及各毒力差异虫株该基因表达水平呈正相关关系，为各毒力不同虫株TatD-like DNase基因表达水平的差异提供了分子基础；利用PCR技术对各流行地区恶性疟原虫TatD-like DNase的保守性进行研究，通过对各流行地区mRNA进行比较相似度为100%，对TatD-like DNase基因全长比对各野生株之间仅存在5%的差异，该基因高度的保守性，为今后疫苗的研制与新型药物的研发奠定了基础；我们通过利用5种不同佐剂，分别与伯氏疟原虫TatD-like DNase进行混合免疫小鼠，结果显示Montanide ISA51组免疫小鼠可以有效抑制小鼠血液中疟原虫的生长与发育，并且小鼠的存活时间最长，证明了Montanide ISA 51为TatD-like DNase的最适宜佐剂。.由以上结果可以看出，TatD-like DNase在疟原虫各个生长阶段全程转录与表达，并且抗TatD-like DNase抗体可以有效抑制疟原虫在有性与无性时期的生长发育，这为今后新型抗疟药物研制、疟疾红内期疫苗与传播阻断疫苗的研制奠定了基础。