冰提丝胶肽结构特性及抗冻作用机制的研究

抗冻蛋白具有结合到冰晶表面，抑制冰晶生长、降低冰点和抑制重结晶作用的抗冻活性，因此可作为一种有效的抗冻添加剂应用于食品的冷冻、储藏、运输和解冻过程以保持食品质量。然而天然抗冻蛋白产量低且成本高，限制了其商业化的应用，因此需要开展一些基础研究并应用计算机辅助设计合成类似物等高新技术开发新型抗冻蛋白。丝胶是我国拥有相当可观数量的一种抗冻蛋白新资源，目前国内外对其研究开发未引起足够重视。因此本课题拟采用冰亲和纯化方法提取丝胶酶解产物中抗冻肽，通过色谱分离纯化，质谱、核磁共振及其晶体结构X射线衍射分析探讨其结构特征；在此基础上，应用理论化学方法，通过分子动力学模拟及量子化学计算研究其与冰晶相互作用的结构特征、模式及不同亲疏水性定点突变体抗冻活性变化规律，并结合相关的理论模型探讨丝胶抗冻肽作用的机制。本研究将为今后开展丝胶抗冻肽类似物定量构效关系、活性分子设计及其抗冻添加剂产品的开发提供科学依据。

本项目主要研究了丝胶抗冻肽冰提取工艺条件，抗冻活性评价方法，通过色谱分离纯化与质谱分析探讨了其结构特征，并对合成的丝胶抗冻肽通过分子动力学模拟研究其与冰晶相互作用的模型，探讨了丝胶抗冻肽作用机制。. 项目研究主要得出如下结果：. （1）建立了一种冰提取丝胶抗冻肽的新型装置，结构简单，材料成本低，冰吸附有效面积大。应用该装置提取丝胶抗冻肽的最佳工艺条件为：提取温度-3℃，丝胶肽浓度为5mg/mL，提取时间3h。. （2）建立了热滞活性、重结晶抑制活性、乳酸菌低温保护活性的分析方法。研究结果表明，冰提丝胶肽的热滞值（THA）达到0.94，高于植物来源的抗冻肽THA值（其值一般为0.2-0.4）；丝胶抗冻肽纯化组分（P4组分）具有明显抑制冰晶生长效果；添加5 mg/mL冰提丝胶肽的乳酸菌存活率高达73.21%，明显高于5%的甘油，而且经过22天冷冻保藏，丝胶肽减少了约45%的乳酸菌细胞由于冷冻胁迫引起的死亡。. （3）冰提丝胶肽通过反相制备色谱分离，得到了抗冻活性较高的P4组分，经过ESI-MS-MS质谱分析得到了一个序列为：TTSPTNVSTT 的肽段。该肽段经过合成，得到SerT短肽。当其添加量为0.1mg/mL时，可使-20°C冷冻保存24h后乳酸菌相对存活率约提高20%。. （4）应用Materials Studio程序软件，构建了冰/SerT真空体系分子对接模型。通过分子动力学模拟研究，结果表明丝胶肽中苏氨酸与天冬酰胺残基与冰晶表面水分子形成较强的氢键作用以及脯氨酸与缬氨酸的疏水作用是丝胶肽抗冻作用的的主要机制。. 以上研究结果证实了丝胶肽具有结合到冰晶表面，抑制冰晶生长和抑制重结晶作用的抗冻活性，其抗冻机制与丝胶肽分子不同氨基酸残基与冰面水分子之间形成的氢键作用及疏水作用等的相互作用密切相关。丝胶抗冻肽明显提高乳酸菌抵抗冷冻或干燥等不利环境胁迫性，因此其作为一种新型的冷冻保护剂在乳酸菌冻干制品加工中具有重要的应用前景。