生物反应器内铁皮石斛原球茎生长动力学及有效物质积累规律的研究

铁皮石斛有极高的药用价值，但目前自然资源濒临枯竭，被列为国家重点保护的中药材之一。铁皮石斛在自然条件下与某些真菌共生才能萌发，很难用实生苗栽培；试管苗移栽方式,因种苗成本高,人工栽培技术不成熟，满足不了市场的需求。为铁皮石斛商业化应用提供大量原料，本项目以铁皮石斛原球茎为研究对象，根据在生物反应器中植物器官生长发育难以像细胞一样实现数据化的特点，拟对底物pH、EC和DO等参数与生物量的相关性进行分析，并利用这些参数变化的数据建立反映反应器培养过程中原球茎生物量变化的生长动力学模型；同时，研究在生物反应器中原球茎生长发育特性及各种理化因子的影响；探明反应器培养时对原球茎中多糖及生物碱等有效物质合成的限制性因子及不同生长期动态变化规律，为铁皮石斛等药用植物次生代谢产物的工业化生产打下基础。

本项目利用气球型气升式生物反应器通过研究影响铁皮石斛原球茎生长和有效物质积累的各种因素，完善了原球茎生物反应器培养体系并探明了反应器内原球茎生长及有效物质积累规律。结果表明项目组制作的气体分布器直径为3.5 cm的反应器适宜铁皮石斛原球茎的培养。在进行原球茎生物反应器培养时，通气量、接种量及光照强度对原球茎生长及有效物质含量影响很大，恒定通气时，0.2 vvm通气量为好；但变量通气更适宜原球茎培养，即随着原球茎的生长将通气量从0.1 vvm逐渐调高，在中后期调节至0.3 vvm。铁皮石斛原球茎生物反应器培养时，在1600 Lux光照强度下原球茎增殖最为有效；而有效物质积累对光照强度要求不同，原球茎中多糖含量由高到低的顺序是2400 lx﹥1600 lx﹥黑暗；生物碱含量顺序依次为：黑暗﹥1600 lx﹥2400 lx。对于原球茎生物反应器培养，蔗糖是最佳的碳源，在蔗糖浓度为30 g/L时，原球茎中多糖及生物碱积累量最多；比起MS培养基，将MS浓度减半，磷浓度调节为1.8 mM，只加入30 mM硝态氮时有利于原球茎生物量及多糖和生物碱的合成；虽然pH 5.8对原球茎生物量积累有利，但pH 7.8时多糖含量最高，而生物碱含量则在4.8最高。原球茎反应器培养的动态研究结果，0~15 d为原球茎生长延迟期，15~30 d为指数生长期，35~40 d为静止期。为了促进对原球茎内生物活性物质积累，进行了几种诱导子处理。发现壳聚糖浓度为30 mg/L和普鲁兰为200 mg/L，水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）均为75 μM时有利于原球茎中生物碱、多糖、黄酮和酚的积累。利用反应器培养原球茎过程中，研究了MeJA处理时间对原球茎生物量和生物活性物质积累的影响，发现在原球茎反应器培养30 d时加入75 μM的MeJA处理4 d为最佳的处理时间，原球茎多糖含量达386.7 mg/g，生物碱为269.45 μg/g，黄酮为5.1 mg/g，酚为4.3 mg/g，这些物质的生产量也均达到最高。对反应器培养原球茎和铁皮石斛栽培植株抗氧化活性进行比较的结果，抗氧化能力MeJA处理的原球茎＞栽培植株＞MeJA未处理的原球茎。因此，利用生物反应器高效培养原球茎可促进铁皮石斛产品的商业化生产。