NAC家族转录因子对铁皮石斛原球茎发生的分子机理研究

Protocorm, dervied from the dormant globular embryo, is a specific structure during the process of seed germination in orchids. It usually can be devided into four stages including meristematic formation, protocorm formation, protocorm differentiation and protocorm degeneration. And the process of protocorm formation is different form the process of embryo development in other monocotyledonous and dicotyledonous plants. However, the mechanism underlying it remains unknown. It will be a model to investigate the specific molecular mechanism of embryo development in orchids. Establishment and development of SAM in protocorm is the key event in protocorm development. Expression pattern-based screening identified some NAC genes that are specifically expressed in the protocorms of Dendrobium candidum Wall ex Lindl in our previous study. In the present work, the potential role of NAC genes in protocorm development were to be investigated, especially in the process of SAM formation, and molecular mechanism underlying it will be elucidated.

原球茎是兰科植物成熟种子中处于球形期的休眠原胚重新启动细胞分裂后形成的一种独特的发育模式，经历分生组织形成期、以及原球茎形成期、分化期、退化期等4个各具特征的连续发育时期，其中在原球茎分化期发生的原球茎顶端分生组织的建立和活动是其独特发育进程的关键，目前对原球茎发育过程的分子调控机制仍属未知。我们在前期研究中发现一些NAC特异基因在铁皮石斛原球茎发育过程中特异表达，本项目拟在筛选出NAC家族转录因子中原球茎发育特异基因的基础上进一步解析这些特异基因在铁皮石斛原球茎顶端分生组织的建立与形成过程中的功能、时空表达、亚细胞定位以及调控网络等，探讨兰科植物特殊的原球茎发生分子调控机制，并为人工调控兰科植物的种子发育提供新途径。

1. 铁皮石斛原球茎的形态发生分析.在铁皮石斛种子非共生培养体系中，果荚中部的种子较两端的种子有较明显的生长优势；通过对各发育时期原球茎的生长曲线分析，发现在原球茎形成前的种胚活化期，活化种胚横向生长快于纵向生长；在原球茎形成及原分生组织形成期间，原球茎纵/横比值近于1，形态似圆球形；在凸起的原分生组织出现明显凹陷以后，原球茎纵向生长快于横向，在球形部分显示明显的形态特征，依次变化为椭球形、哑铃形等；此后，纵/横比值稳定，但哑铃形两端变化明显，显示出由基部开始的退化现象。.2. 铁皮石斛原球茎发育过程的基因表达分析.完成处于原球茎形成期、原分生组织形成期和SAM形成期的铁皮石斛原球茎的转录组分析，共获得了30,898条Unigenes注释结果，经数据分析获得NAC的Unigenes序列，应用RACE技术验证并获得了62个铁皮石斛NAC家族成员，并已获得了其中40个的全长cDNA序列。目前我们正开展3个方面的研究工作：(1) NAC家族各成员在铁皮石斛原球茎各发育时期的q-RT PCR分析，现正进行内参基因筛选以及NAC特异引物设计；(2) 根据cDNA全长序列进行铁皮石斛NAC家族的基因组序列克隆以研究NAC家族的基因组进化发育，目前已获得了5个NAC家族成员的DNA序列克隆；(3) 继续挖掘与铁皮石斛原球茎发育有关的其它特异基因。.3. NAC转录因子AtNAC1与目标DNA的结合研究.进行了拟南芥AtNAC1的分子建模及其与目标DNA (5’-CTGACGTAAGGGATGACGCAC-3’)的分子对接研究。发现AtNAC1通过3个β-折叠结合DNA，其核心基序WKATGKD插入DNA大沟，参与结合AtNAC1的DNA基序为5'-CTGACGTA-3'和5'-GATGACGC-3'。Lys102、Ala103、Thr104、Gly105、Lys106和Asp107与DNA的碱基结合，起到识别和结合作用，而Arg91、Thr92、Asn93、Lys135、Asp137、His141、Phe169和Lys171与DNA的磷酸骨架结合，起到增强AtNAC1与DNA的亲和力的作用。该项研究结果首次提供了AtNAC1与DNA结合的in silico结合模式，将为我们后续研究NAC的结构与功能提供一些新的思路。.4. 发表相关学术论文3篇，其它论文3篇。