超高温热袍菌醛/醇脱氢酶的生理功能鉴定和优化及其表达调控研究

Thermophilic fermentation has advantages for approaching consolidated processes and ultimately lowers the costs of cellulosic ethanol production. The tendency of metabolic engineering is to employ the hyper thermophilic bacteria able to degrade lignocellulose. However, the key enzyme of three-step ethanol fermentation pathway has not been identified in these microorganisms, and the their functions have not been reported although many alcohol dehydrogenase gene are sitting in Thermotoga spp. genomes. This project is to identify and improve the functions of these alcohol dehydrogenases, to study the promoters and regulate genes in the operons for main pathways of fermentation; to use strong promoters and regulation systems for the expression of target dehydrogenase genes, and to examine and improve the gene expression levels. The research results can reveal the nature of ethanol production at hyper thermophiles, find new gene resources, and obtain gene clusters for supplement an ethanol fermentation pathway in a hyper thermophile.

利用高温菌进行纤维素乙醇的发酵有望实现生物降解、发酵、蒸馏等过程的同步化，从而最大限度地降低生产成本。纤维素乙醇高温发酵研究正趋向于利用能有效降解纤维素的超高温细菌。乙醇发酵三酶途径需要醛醇脱氢酶的参与。但是，在超高温菌中迄今未发现催化乙醛产生的醛脱氢酶；而醇脱氢酶基因编码的酶可以有三种类型：醛脱氢酶、生成或消耗乙醇的脱氢酶。本项目拟解析Thermotoga spp.基因组中出现的生理功能不明的醇脱氢酶基因，并对已知最高温的醛、醇脱氢酶进行优化；同时，研究热袍菌发酵途径关键基因的转录及调控机制；用强启动子及其体外转录控制高活性脱氢酶基因的表达；通过体外转录测定和优化目标基因的表达，获得一个能在热袍菌中高效表达的醛/醇脱氢酶基因模块。本研究将阐明超高温菌的乙醇发酵三步途径的自然科学问题，能够发现和优化催化乙醇超高温发酵的所需基因，为实现超高温乙醇发酵获得高效表达高活性醛/醇脱氢酶的基因模块。

在超高温条件下发酵纤维素乙醇，可避免发酵材料的高温灭菌和灭菌后的冷却过程，并且有望实现纤维素水解、乙醇发酵、乙醇蒸馏过程的同步化。长期以来，研究工作的最大障碍是在超高温菌中一直没有发现从乙酰辅酶A产生乙醇的代谢途径。本项目解析了Thermotoga spp.基因组中出现的生理功能不明的醇脱氢酶（Adhs）基因，首次发现一个具有醛、醇脱氢酶双重活性的酶（Fe-AAdh），在体外能够催化从乙酰辅酶A产生乙醛，并进一步还原乙醛产生乙醇。本项目在模拟的生理条件下测定这些醛、醇脱氢酶的活性从而鉴定其生理功能，结果发现这些酶比极端高温菌中相关的酶的分工更为细致。研究还发现，Fe-AAdh对还原力具有较强的依赖性，并且与其他醇脱氢酶之间具有较强的协同作用。该项研究为超高温纤维素乙醇发酵途径的建立奠定了基础。