利用基因敲除动物模型研究附睾特异性表达基因的功能及其补偿机制

The investigation indicates that the semen quality and male fertilizing capacity are gradually decreasing. This makes it become more and more important to strengthen the study of male reproductive health. Mammalian sperm are produced in the testis, and then they become mature and fertilizing capacity during transit through the epididymis, situated next to the testis. So it is theoretically and clinically important to investigate the regulation of sperm mature in epididymis. Over the past years, we obtain some achievements on research of regulation of sperm mature in epididymis. We have found some novel genes and their function in sperm maturation. Recently we discovered that the conventional knockout of an epididymis-specific gene did not result in the fertilizing deficiency; while the conditional knockout of this gene caused the loss of fertilizing ability. These suggest the presence of compensation mechanism on gene regulation in the epididymis. However, the molecular basis underlying compensation mechanism remains unclear. Based on our previous works, we will investigate roles of the epididymis-specific genes and compensation mechanisms by using conventional and conditional knockout of a certain epididymis-specific gene. the expected achievements will be of helps not only in better understanding the molecular mechanisms of sperm maturation, but also in providing some new ideas for male contraceptive drug design and male infertility diagnosis and treatment. This project also supplied a good research model in epididymis and even reproductive fields.

男性精液质量和生殖力的逐步下降对加强男性生殖健康的基础研究提出了迫切要求。精子从睾丸产生后必须要经过附睾成熟过程才具备卵子结合与繁殖能力。所以，对附睾中调控精子成熟的功能基因进行细致深入地研究具有重要的理论和应用价值。近年来，我们实验室在附睾精子成熟调控方面取得了一些原创性成果，发现并阐明了多个与精子成熟调控相关蛋白的功能。最近我们发现，附睾特异性表达基因传统性敲除动物并没有生殖缺陷，但是同一基因条件性敲除或短时间的基因干扰敲低的动物则呈现生殖缺陷的表型，提示附睾存在基因功能补偿的调节，但是其过程或分子机制尚不清楚。本项目拟在前期工作基础上，利用同一基因传统性和条件性敲除小鼠来研究附睾特异性表达基因的功能及其补偿机制，所获成果不仅有助于阐明精子成熟调控的分子机制，亦为解决临床不育、不孕症和男性避孕药的研制提供新的靶点和依据。同时，还为附睾乃至雄性生殖系统基因调控的研究提供动物参考模型。

精子从睾丸产生后必须要经过附睾成熟过程才具备卵子结合与繁殖能力。所以，对附睾中调控精子成熟的功能基因进行细致深入地研究具有重要的理论和应用价值。敲除技术是研究基因功能最重要的手段之一，以往我们一系列附睾特异性表达基因的传统型敲除动物模型均显示，长时间基因敲除并没有出现精子或者生育缺陷的表型，而同一基因在短时间内进行干扰敲低则呈现生殖缺陷的表型，提示附睾存在基因功能补偿的调节。为此我们建立了附睾同一个基因敲除不同时间的小鼠模型，以探讨基因功能及其调节的补偿效应。.首先我们检测了小鼠Lipocalin家族Lcn6基因的表达模式和具体定位。发现小鼠Lcn6基因只特异性表达在附睾头部，且起始端Lcn6mRNA高丰度表达在管壁底部细胞中，而头部近端Lcn6mRNA呈花环状排列，并不局限于管壁底部细胞。然后，我们采用他莫西芬诱导的条件性Lcn6基因敲除小鼠制备了幼年时期开始敲除的长时间Lcn6基因缺失小鼠和成年时期开始敲除的短时间Lcn6基因缺失小鼠模型。结果表明，成年期敲除Lcn6基因，小鼠精子内钙水平和顶体反应均发生异常，而幼年期Lcn6基因敲除小鼠成年后精子两个指标均没有显著变化。进一步研究发现，幼年时敲除Lcn6基因的小鼠模型中，其成年后附睾Lipocalin家族另一成员Lcn2基因的表达水平显著增加，成年后才敲除Lcn6基因的小鼠附睾中各Lipocalin成员的表达没有变化。提示Lcn6家族其他成员可以补偿其敲除后的功能。本研究不仅表明Lcn6在调节精子内钙离子和顶体反应中发挥重要作用，而且揭示了附睾特异性表达基因特别是同家族成员调控精子成熟功能具有补偿机制。成果为精子成熟调控机理的阐明提供了新的资料，亦为临床精子功能缺陷诊治提供新的启发。.结题时已发表标注此项目批准号的SCI研究论文8篇，其中3篇影响因子（5年IF）大于5.0。参与本项目的2名博士生已经顺利毕业，并且获得了博士学位。