土壤因子对芽孢杆菌抗菌物质合成及其基因表达的影响

Due to instability of biocontrol effect of microbial agents on crop soil-borne diseases, this study will use the screened Bacillus strains (B1, B2, et al) with efficient biocontrol effect to identify antibiotic gene and gene clusters by using whole genome sequencing and real-time quantitative PCR. Identification and quantification of antibiotic compounds will be determined by LC-ESI-MS, The structure of unknown antibiotic compounds will be identified by NMR. The best culture conditions of the strain for increasing gene expression and antibiotic production will be determined by using response surface method. The pot and field experiments of banana wilt will be used to get the dynamic variation rule of disease indexes of banana plant wilt, concentrations of antibiotic substances, and gene expression level under various soil factors (pH, clay mineral, aggregate), as well as application processes ,such as organic fertilization, seed soaking, soil watering and soil inoculation.In consequence, the main soil nutrients, environmental factors and inoculants application methods in the field that affect the synthesis of antibiotic substances and the expression of functional genes will be clarified. This study will elucidate modes of action of growth-promoting and antibiotic Bacillus strains, and provide theoretical foundation for stabilizing effects of potential biocontrol agents in the field.

针对作物土传病害生物防治中田间效果不稳定等问题，本研究在已筛选生防芽孢杆菌(B1、B2等)的基础上，采用全基因组测序和定量PCR等方法分析各菌株的防病相关基因和基因簇，高效液相色谱-电喷雾-质谱(LC-ESI-MS)方法检测主要抗菌物质种类和浓度，核磁共振(NMR)方法鉴定未知抗菌物质的化学结构，以期明确各菌株的主要抗菌物质和抗菌相关基因。采用响应面设计，找出供试菌株的主要抗菌物质合成和基因表达的最佳培养条件。以香蕉枯萎病为试验材料，采用盆栽和田间试验，比较不同土壤因子(pH, 粘土矿物，团聚体等)和施用方法(有机肥配合、浸种和浇根等)处理下植株病情指数、土壤中抗菌物质浓度和基因表达量的动态变化规律，进一步确证能提高芽孢杆菌抗菌活性物质浓度及其功能基因表达量的主导土壤养分因子、环境因子及田间施用方法。研究将为深入理解芽孢杆菌生防分子机理和保障田间生防潜力高效稳定发挥提供理论依据。

集约化农业推动了农业生产率和作物产量的大幅度提高，但长期大量和不合理施用化肥和化学农药、作物连作或不合理种植，导致作物土传病害严重，造成作物严重减产或失收。生防芽孢杆菌对环境友好，能产生多种抗菌物质和生长素，同时其批量生产工艺简单、货架期长等优点，在作物防病促生方面显示了巨大的优势。.本项目对高效生防贝莱斯芽孢杆菌118、Y6和F7进行了全基因组测序。采用超高效液相色谱–串联质谱法（UPLC–MS）鉴定出118，Y6和F7分泌的主要抗菌活性物质脂肽，并鉴定出表面活性素（C13/C17）、伊枯菌素（C14/C17）和丰宁素(C13/17)共15种同系物。采用定量PCR和LFH-PCR等方法构建了Y6的表面活性素、伊枯菌素和丰宁素合成基因缺失株，采用平板spot and lawn assay和盆栽植株防病试验，明确了伊枯菌素和丰宁素合成基因参与抑制青枯菌功能，但只有伊枯菌素合成基因参与抑制尖胞镰刀真菌。另外还发现伊枯菌素和丰宁素合成基因参与芽孢杆菌生物膜形成、游动和蠕动运动等功能。.另外成功筛选高效根际促生、溶磷菌株10多株，其中X3，J5为高效产生长素的巨大芽孢杆菌。建立了方便实用和效果好，可操作性的田间施用方法。多次试验摸索，比较各种菌剂田间施用方法，建立了浇灌植株根际的施菌技术，方便实用，均能较好的促生植物生长和增加作物产量。构建解淀粉芽孢杆菌118的sigX, sigM,sigW等基因缺失株10多个，探讨了这些基因在调控土壤定殖、移动性、生物膜和耐盐渍、防病促生方面的作用。研制了耐盐渍生物菌剂2种，筛选出JK1和JK2的优化原料配方和低成本高效的发酵工艺。在提高玉米植株生物量，提高土壤磷有效性，促进玉米产量等方面的应用具有显著的效果。探究了生物肥料的菌剂配方、生产工艺，并在田间施用上达到预期效果。.项目研究将为芽孢杆菌田间防病促生潜力稳定高效发挥提供科学依据，对控制作物土传病害、促进生防菌剂的大面积推广应用、提高作物产量和品质、减少环境污染以及保障人类健康都有重要的理论和实践意义。