基于电致化学发光的阻抗显微成像技术用于细胞通讯研究

The physiological processes of cells depend on the constantly dynamic exchange of substances and information, and the abnormalities in cell communication are closely related to many diseases. Therefore, monitoring the variations of signal carriers in cell communication is of importance to elucidate the mechanism of physiology and pathology. Although a few of techniques have been developed so far, in situ tracking the spatial and temporal information of cell communication kinetics of single cells has been a challenge. Here, we develop an electrochemiluminescence-based impedance microscopy for assessing the kinetics in signal generation and recognition in cell communication. In comparison to classic electrochemiluminescence microscopy collecting luminescent intensity, electrochemiluminescence-based impedance microscopy analyzes the deviation in terms of frequency, amplitude, and phase between intensity of each pixel and modulation voltage, which enables this technique to map the local impedance when alternating voltage of different frequency modulates the electrochemiluminescence images. Because of integrating the merits of two techniques: low background and high spatiotemporal resolution from electrochemiluminescence microscopy, label-free and high stability from impedance technique, electrochemiluminescence-based impedance microscopy, at single-cell level, can not only assess the releasing rate of exosomes for evaluating the metastatic activity of cancer cells, but also measure the binding kinetics of membrane proteins for elucidating the underlying molecular mechanism of drug resistance of cancer cells. This technique provides a novel technique and approach for assessing cancer outcomes and accelerating the development of new drugs.

细胞的生命活动是物质与信息不断交换的动态过程，其通讯过程的异常与疾病密切相关，因此监测细胞通讯中信号物的变化，对阐明生理与病理机制至关重要。尽管目前已开发多种传感技术，但从单细胞水平原位获取通讯过程的时空变化动态信息仍然是一个挑战。针对上述难点，本项目拟开发基于电致化学发光的阻抗显微成像技术，来研究细胞通讯中信号发射与识别的动态过程。区别于传统电致化学发光成像以光强作为检测信号，本项目使用变频正弦交流电压来调制电致化学发光成像信号，通过分析每个像素点强度与调制电压在频率、幅值和相角上的差异，来还原电化学阻抗的空间分布图像。此技术结合电化学发光成像的低背景、高时空分辨，和交流阻抗技术的免标记、高稳定性的优点，能够从单细胞层面，原位分析外泌体分泌速率并评估癌细胞转移活性，和测定细胞膜蛋白与抗体的结合动力学并研究细胞耐药性机理。本项目的实施为评估癌症预后与加快新药研发提供了新技术和新方法。

细胞通讯过程的相关研究是近年来生命科学与细胞生物学的重要研究前沿，为了解决目前分析检测中时空分辨率较低、检测通量较小、灵敏度较低的问题，我们通过采用电化学发光显微成像等一系列分析手段，开发了具有空间分辨能力的显微成像仪器和光学电学质谱联用的分析一体化装置。发现了单细胞分泌铜离子的动力学变化，以及细胞内不同细胞器结构的分布。当细胞受到外界电压刺激下，细胞会发生接连性的电穿孔过程，并且细胞内分子的传输会受到细胞骨架黏度的影响。利用胺基化碳点作为共反应剂，能够特异性地靶向凋亡细胞膜表面外翻的磷脂酰丝氨酸，实现细胞上表面膜的电化学发光成像。随后利用富含鸟嘌呤的金纳米花作为协同共反应剂，极大增强了成像灵敏度，实现细胞表面CEA抗原的识别。我们还发现了电化学发光闪烁现象，并且用于监测单个纳米颗粒的析氢反应。将单个氮化碳纳米球和钙钛矿结合，发展了比率型电致化学发光传感器用于高灵敏细胞膜蛋白分析，并开发的Janus电化学发光发射体，集成了三联吡啶钌和鲁米诺两种发光团，用于双通道检测两种mi-RNA。此外，还开发了银壳金核的光学探针和纳米卫星胶囊用于监测细胞内羟基自由基、端粒酶和DNA甲基化水平。并且利用光学、电化学和质谱揭示了BODIPY染料也存在催化路径的电化学发光。通过半导体的光电转化性能，我们开发了钙钛矿适配体传感器和分子印迹策略，能够对环境中的污染物进行检测。通过将三联吡啶钌和四苯乙烯共价偶联，利用这种新型分子的结晶诱导增强电化学发光过程，实现将聚集诱导猝灭转换为聚集诱导增强发光。利用温度控制的热控电极技术，可以可逆调节电化学发光的发光层厚度，实现对于单细胞不同高度的断层成像。凭借相关工作的研究积累，我们阐述了电化学发光在成像和分析检测中的优势，探讨了不同发光机理对成像效果的影响。项目对于单细胞成像、电化学发光生物传感和显微镜创制等领域起到了推动作用。