安莎类抗生素聚酮链释放与环化机制的结构生物学研究

Ansamycin exhibits a number of biological and pharmacological activities. Biosynthetic investigations had revealed that amide synthase is responsible for the release and cyclization of polyketide chain in ansamycin biosynthesis. However, its catalytic mechanism is different from the thioesterase domain of type I polyketide synthase, and represents a novel biosynthetic pattern for release and cyclization of polyketide chain.. In the previous study, we researched the release and cyclization of polyketide chain function of amid synthase, and its protein-protein interaction by in vivo and in vitro experiment. Moreover, the soluble expression of amid synthase Asm9 in Ansamycin biosynthesis was successfully obtained. On the basis of introduction of the enzyme reaction characteristics, we will try to explain the catalytic mechanism of Asm9 by analyzing its crystal structure, and the cocrystallizations with substrate and ACP of last polyketide module, respectively. Furthermore, we will compare the catalytic differences of the amide enzymes from different sources through homology modeling and molecular docking technology. At last, the results above will facilitate the directional reconstruction of amide enzyme.

安莎霉素在临床和药理学研究中均表现出广泛的生理活性。生物合成研究发现，安莎类抗生素生物合成基因簇中负责聚酮链释放的是酰胺合酶，与典型的I 型聚酮合酶C末端存在的硫酯酶有较大的差异，代表着一类新颖的聚酮链释放和成环机制。. 前期对于该项目的研究中，通过相关的体内体外实验，开展了酰胺合酶对安莎类抗生素生物合成中释放与环化的体内功能分析，和蛋白间相互关系的考察，并实现了来源于安丝菌素生物合成中的酰胺合酶Asm9的可溶性表达。接下来，拟继续以酰胺合酶Asm9为主要的研究对象，在阐述酰胺合酶催化聚酮链释放与环化的酶促反应特征的基础上，利用结构生物学技术来解析酰胺合酶，及其分别与底物、聚酮合酶模块末端ACP共结晶的晶体结构，来解释酰胺合酶Asm9催化机制；并通过同源建模和分子对接技术，比较不同酰胺合酶对于安莎环的催化差异。最后利用所得到的结构生物学结果和定点突变技术来实现酰胺合酶的定向改造。

安丝菌素是重要的抗肿瘤药物，本项目以安丝菌素生物合成中的酰胺合酶Asm9为主要的研究对象，主要开展酰胺合酶的酶促反应特性的表征；尝试通过酰胺合酶基因的结构生物学研究来揭示其催化的机理；并通过底物与酶的共结晶来明确蛋白活性区域的关键氨基酸残基，进而发现催化形成不同安莎聚酮环大小的酰胺合酶的结构基础和关键氨基酸；并拟整合相关的结构生物学数据，通过定点突变技术改造安莎类抗生素，以形成不同安莎聚酮环大小的目标产物。在本项目的支持下积极拓展研究了安丝菌素结构类似物ansacarbamitocin的生物合成，克隆了该化合物中的酰胺合酶，积极解析了其相关的生物合成后修饰途径。同时，发现了来源于ansacarbamitocin和格尔登素中的酰胺合酶基因可以与安丝菌素的酰胺合酶具有功能互补性。为了系统地对安莎类抗生素的成环和释放机制进行研究，我们收集了安丝菌素、利福霉素、格尔登霉素、Rubradirin、萘霉素和 Ansatrienin 等安莎类抗生素的产生菌，并且成功构建了安丝菌素、格尔登霉素、萘霉素和 Ansatrienin 产生菌的高效接合转移遗传操作系统；在此基础上，主要以链长适中的安丝菌素为研究对象，结合体内体外实验，深入探究酰胺合酶对安莎类抗生素释放与环化的机理。此外，针对重要的多烯类抗生素是大环内酯抗生素的聚酮链的释放研究也进行了努力的拓展。多烯类抗生素具有重要的抗真菌、抗寄生虫等活性。本研究致力于通过解析多烯类抗生素硫酯酶结构域的晶体结构，通过衍生物和硫酯酶结构域共同建模，发掘结构域中与脱羧-甲基衍生物互作的关键氨基酸，来解析硫酯酶的催化机理，为以后硫酯酶结构域的体外进化提供理论依据，通过硫酯酶结构域的突变和改造来提升多烯类抗生素脱羧-甲基衍生物的产量。