安莎类抗生素聚酮链的释放与环化

以安丝菌素、利福霉素为代表的安莎素类抗生素，具有抗肿瘤、抗菌等广泛的生理活性，在临床和药理学研究中均表现出良好的效果。从生物合成角度分析，安莎类抗生素由I型聚酮合酶催化形成。在典型的I 型聚酮合酶的C 末端存在一个属于α/β 水解酶超家族的硫酯酶TE结构域，负责催化分子内或分子外的亲核反应实现聚酮链的释放。.前期研究发现，安莎类抗生素生物合成基因簇中负责聚酮链释放的蛋白是由芳胺N-乙酰转移酶家族的酰胺合酶基因编码，与硫酯酶有较大的差异，可能代表着一类新颖的聚酮链释放和成环机制。因此本项目采用安丝菌素、萘霉素、利福霉素、格尔登素等产生菌为研究材料，拟结合体内体外实验开展酰胺合酶对安莎类抗生素释放与环化的遗传功能确定、利用化学合成底物进行体外酶催化分析、定点突变确定其关键氨基酸特征以及考察酰胺合酶和聚酮模块末端酰基载体蛋白之间的关系等方面工作，来阐明酰胺合酶对安莎类抗生素释放和环化的机制。

安莎类抗生素生物合成基因簇中负责聚酮链释放的蛋白是由芳胺N-乙酰转移酶家族的酰胺合酶基因编码，与典型的I 型聚酮合酶的C末端硫酯酶有较大的差异，代表着一类新颖的聚酮链释放和成环机制。因此本项目采用了安丝菌素、萘霉素、利福霉素、Rubradirin等产生菌为研究材料，结合体内体外实验开展了相关的研究，取得了以下研究成果。 .1、在安莎类抗生素基因簇的克隆及酰胺合酶基因的挖掘实验中，我们成功克隆了负责萘霉素生物合成的106 kb的基因簇，不仅阐明了萘霉素的生物合成机理，而且发现了natF为萘霉素生物合成中的酰胺合酶基因，该工作发表在Molecular BioSystems杂志上。.2、在安丝菌素后修饰顺序的阐述明确酰胺合酶基因的底物方面，首先通过体内基因失活与互补实验确定了基因asm10 的遗传功能；并在大肠杆菌中实现了可溶性表达。对其系统的测定了相关的Km 和kcat 数值，该部分的研究工作发表在ChemBioChem 杂志上。另外，我们通过体内基因失活与互补以及静息细胞实验确定了asm21对安丝菌素前体C-7 位和糖苷的葡萄糖基上的C-4 和C-6 位氨甲酰化的功能相关性，接着我们在大肠杆菌得到了可溶性表达的Asm21 蛋白，最后利用相关的底物表征了Asm21催化的二重性及在安丝菌素生物合成中的确切顺序。该工作发表在了Chemistry & Biology 杂志上。.3、我们进一步利用体内基因突变与互补实验验证了酰胺合酶基因对于安莎类化合物合成的相关性，也发现了安莎类抗生素之间的酰胺合酶基因没有功能互补性；其次，进一步的通过末端ACP的置换实验以及细菌双杂交实验考查了末端ACP与酰胺合酶之间的关系；最后，为了进一步的明确酰胺合酶的催化机制，利用大肠杆菌作为表达宿主成功对其的进行了异源表达，并且考察了酰胺合酶和聚酮模块末端酰基载体蛋白之间的关系，阐明了酰胺合酶对安莎类抗生素释放和环化的机制。.最后，在本项目的开展过程中还应国际权威杂志Natural Product Reports和Biotechnology Advances杂志的邀请，分别撰写了综述文章。通过本项目的研究，共计发表了7篇SCI研究论文，申请了1项专利，培养了2名硕士研究生和4名博士研究生，出色完成了预期的任务和指标。此外，安莎类抗生素聚酮链释放和环化的结构生物学研究还得到了青年基金的继续资助。