基于泛素-蛋白酶体途径研究Hsp70在RGS4介导的吗啡诱导行为敏化中的作用机制

Previous research has shown that local knockout of regulator of G protein signaling 4 (RGS4) from nucleus accumbens (NAc) of mice promoted repeated morphine-induced conditioned place preference and behavioral sensitization. Moreover, cellular experiments demonstrated that the down-regulation of RGS4 at the post-transcriptional level was mediated by ubiquitin-proteasome system (UPS). Our previous research indicated that heat shock protein 70 (Hsp70) in NAc core played an indispensable role in the development of behavioral sensitization induced by a single morphine exposure in rats, but the in-depth molecular mechanisms underlying it are not well known. One of the biological functions of Hsp70 is to assist in UPS-mediated protein degradation. Thus, whether Hsp70 mediates the development of morphine-induced behavioral sensitization by assisting RGS4 protein degradation through UPS is worth investigating. Based on these findings, we will utilize stereotaxic surgery and microinjection, co-immunoprecipitation, double staining immunofluorescence, gene knockdown and overexpression to explore: 1.the alteration of RGS4 expression and its role in the development of behavioral sensitization induced by a single morphine exposure in rats; 2.the interaction between RGS4 and Hsp70, and whether Hsp70 mediates the development of morphine-induced behavioral sensitization by assisting UPS-dependent RGS4 protein degradation. This research will shed more light on the molecular mechanisms underlying opioid addiction and provide reference to the strategy for its prevention and treatment.

文献报道，小鼠伏核（NAc）内敲除G蛋白信号转导调节蛋白4（RGS4）可促进多针吗啡诱导的行为敏化和条件性位置偏爱，且在细胞水平上，阿片受体激动剂在转录后水平下调RGS4的表达是通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）介导的。我们前期发现，热休克蛋白70（Hsp70）在阿片成瘾模型——单针吗啡诱导大鼠行为敏化中发挥重要的促进作用，但是具体机制不明。Hsp70的功能之一是辅助UPS降解底物，那么Hsp70是否通过辅助UPS降解RGS4介导行为敏化值得进一步研究。基于此，我们将利用大鼠脑立体定位及核团微量注射、免疫共沉淀、免疫荧光双染、基因敲低和过表达等方法探索：1.在单针吗啡诱导行为敏化形成期RGS4的表达规律及其在敏化中的作用；2.Hsp70与RGS4的相互作用及Hsp70是否通过辅助RGS4的泛素化降解介导单针吗啡诱导的行为敏化。本研究将进一步阐释阿片成瘾的分子机理，为该病防治策略提供参考。

背景：阿片类药物成瘾是一个重大的公共卫生问题，但其潜在机制尚不清楚。前期研究表明，泛素-蛋白酶体系统 (UPS)、热休克蛋白和G蛋白信号转导调节蛋白与阿片类药物成瘾有关。本研究的目的是进一步探索 UPS, G蛋白信号转导调节蛋白4 (RGS4)和热休克蛋白70 (Hsp70)在吗啡诱导的行为敏化（一种阿片类药物成瘾的动物模型）中的作用。主要研究内容：结合行为学和分子药理学，以伏核核部(NAc core)为核心，探讨单针吗啡诱导大鼠行为敏化形成期RGS4、Hsp70及多聚泛素化蛋白表达的特征，以及蛋白酶体抑制剂（lactacystin）和MG132对行为敏化和目标蛋白表达的影响。重要结果：1）在行为敏化形成期，NAc核部的多聚泛素化蛋白表达和Hsp70蛋白表达均呈时间和剂量相关性升高，而RGS4蛋白表达在此阶段没有显着变化；2) LAC全身给药对行为敏化有抑制作用，而MG132没有这种作用；3) LAC 脑立体定位给药至NAc核部可降低该部位多聚泛素化蛋白的表达，并抑制行为敏化。结论和科学意义：单针吗啡诱导大鼠行为敏化的形成伴随着多聚泛素化蛋白和Hsp70蛋白表达增加，而RGS4蛋白表达无明显变化。更重要的是，UPS 对行为敏化的形成具有正调控作用。本研究首次探索了在行为敏化形成期Hsp70，RGS4和多聚泛素化蛋白表达的特点，并证明UPS在单针吗啡诱导大鼠行为敏化中具有正调控作用，这为进一步研究阿片类药物成瘾分子机制提供了理论基础。本课题资助发表SCI论文2篇，英文论文1篇，尚有1篇SCI论文在投，参编著作1部，在国际会议上做口头报告1次，晋升高级职称3人，协助培养研究生1名。