不同人胰淀素聚集程度通过TLR4/MyD88介导调节性T细胞免疫机制

Islet amyloid deposition is absent in autoimmune Type 1 diabetes (T1D). We have found that islet amyloid may associate with inflammatory inhibition in islet. Further we have proved human amylin (IA), the principle protein in islet amyloid deposits, could induce the expantion of CD4+FoxP3+ regulatory T cells (Treg) and regulate the expression of toll-like receptor (TLR) to reduce the risk of incidence of autoimmune T1D in NOD mice. Our findings implicate that hA may modulates immune regulation. Here we plan to observe different states of hA aggregates to stimulate TLR4/MyD88-mediated Treg proliferation and differentiation, while we research for the impact on cytokine production and pathway TGFβ/Smad/ERK expression in human peripheral blood and co-culture model of mouse islet-spleen cells by using flow cytometry analysis, cytometric beads array, western blot and immunohistochemistry. Then we illustrate the molecular mechanism of hA aggregates-induced Treg immune regulation and its influence of islet cell apoptosis. Exploring the immune-regulating hA may provide a new approach and drug targets to the control for T1D-related autoimmune and pro-inflammatory therapy.

自身免疫性1型糖尿病（T1D）中不发生胰岛淀粉样沉积。我们临床病理学研究发现胰岛淀粉样沉积可能与胰岛炎症抑制有关，进而通过细胞和动物实验证实胰岛淀粉样沉积中的主要蛋白-人胰淀素（hA）可诱导CD4+FoxP3+调节性T细胞（Treg）形成，影响Toll样受体（TLR）表达，并降低NOD小鼠T1D发病风险，提示hA参与免疫调节。本项目利用流式细胞分析、免疫磁珠、蛋白印迹、免疫组化等技术，观察不同聚集程度hA在人外周血和小鼠胰岛-脾细胞共培养模型中经由TLR4/MyD88依赖性途径介导Treg增殖分化情况，探讨不同聚集程度hA对T淋巴细胞炎症因子释放及TGFβ/Smad/ERK信号通路的影响，进而阐明其诱导Treg免疫调节作用进而影响胰岛凋亡的分子机理，旨在揭示hA聚集特性在自身免疫性T1D发生发展中的重要作用，为临床改善T1D的自身免疫反应和促炎状态提供可能的治疗途径和药物靶点。

胰淀素是胰岛内分泌重要的激素，与胰岛素共同由胰岛β细胞合成与分泌，协同调节糖代谢。我们前期研究发现人胰淀素（Human Amylin, hA）有免疫调节作用，能抑制CD4+ Foxp3-效应T细胞增殖，可降低NOD小鼠自身免疫性疾糖尿病的发病率。在本项目中，我们诱导hA形成三种不同聚集程度的蛋白构象。接着，通过三种不同聚集程度的人胰淀素分别干预共培养细胞，脾淋巴细胞经过流式细胞分析，发现CD4+CD25+ CD127low Treg细胞在hA单体组中有显著增加，CD4+CD127+ Th17细胞与CD4+ CD25+CD127low Treg细胞的比值（Th17/Treg）在寡聚体组明显高于其他组细胞。观察干预hA不同构型后，通过胰岛素刺激分泌实验，发现hA寡聚体、纤维体会影响低糖、高糖刺激胰岛素的分泌，其中寡聚体对胰岛素分泌的影响比较明显，单体则无明显影响。用实时定量PCR、ELISA、Western Blot等手段测定胰岛细胞中TLR4、TGF-β/Smad/ERK通路中相关基金和蛋白的表达量，发现hA在胰岛细胞中，可能通过TLR4/MyD88依赖性通路进行免疫因子调节作用，hA单体在胰岛细胞中不易引起IL-1b诱导的炎症反应，也不易引起Caspase3途径的细胞凋亡，而寡聚体和纤维体在炎症反应和细胞凋亡中起到一定作用。通过MyD88抑制剂，三种hA蛋白构型均对TLR4表达的增强效果减弱，MyD88表达降低后，对TRIF的抑制效果也相应减弱。临床上多数出现hA淀粉样沉积的病人会有肥胖、高血压等症状，而使用二甲双胍可缓解其症状。课题组通过网络药理学分析二甲双胍对肥胖高血压的影响和分子互作机制。二甲双胍可能通过功能性调节炎症和免疫信号通路来改善肥胖调节组织的代谢稳态和改善血压依赖性微环境，从而发挥有效的抗高血压和肥胖作用。